Aplicación deUltrafiltración enEextracción deNnaturalCOllagen

 

Ⅰ.¿Qué es el colágeno?

El colágeno es un biopolímero, el principal componente del tejido conectivo de los animales, y también la proteína funcional más abundante y ampliamente distribuida en los mamíferos, representando entre el 25% y el 30% de la proteína total, e incluso hasta más del 80% en algunos casos. organismos. Desempeña el papel de unión del tejido en las células animales.

Según la medición, un adulto tiene alrededor de 3 kg de colágeno en su cuerpo, que está presente principalmente en la piel, huesos, ojos, dientes, tendones, órganos internos (incluidos el corazón, el estómago, el intestino y los vasos sanguíneos) y otras partes. del cuerpo humano. Su función es mantener la morfología y estructura de la piel y los órganos, y también es una materia prima importante para la reparación de tejidos dañados.

II. Extracción de colágeno de escamas de carpa herbívora mediante ultrafiltración

1. Materiales y métodos

1.1 Muestras de prueba

Extracto acuoso de colágeno crudo.

1.2 Métodos de prueba

1.2.1 Proceso de ultrafiltración

1.2.2 Determinación del proceso de prefiltración

En esta prueba, el proceso de prefiltración óptimo se determina mediante el análisis comparativo del método de filtración al vacío y el método de microfiltración. Los métodos de prueba específicos son los siguientes:

① El extracto acuoso de colágeno crudo se filtra mediante un método de filtración al vacío con papel de filtro para eliminar las partículas suspendidas y las impurezas en el extracto acuoso.

② El extracto acuoso de colágeno crudo se filtra con una membrana de microfiltración de 0.2 μm para eliminar sustancias insolubles, impurezas, etc. en el extracto acuoso.

1.2.3 Elección del tamaño de poro de la membrana de ultrafiltración

Durante la purificación, el tamaño de los poros de la membrana de ultrafiltración es de 100 kDa.

1.2.4 Experimento de factor único del proceso de purificación por ultrafiltración.

El extracto acuoso de colágeno crudo se purifica mediante tecnología de ultrafiltración. Estudie el experimento de factor único del efecto de la presión de funcionamiento, la temperatura de funcionamiento y el pH sobre la retención de colágeno. Después de poner en marcha el equipo de ultrafiltración durante un período de tiempo, estudie el efecto de varios factores sobre la tasa de retención de colágeno.

1.2.5 Fórmula de cálculo

2. Resultados y análisis

2.1 Análisis del proceso de prefiltración

Consulte la siguiente tabla para ver los resultados comparativos del método de filtración al vacío y el método de microfiltración.

Método de filtración	Concentración de la solución antes de la filtración/(g/L)	Concentración de la solución después de la filtración/(g/L)	Fenómenos sensoriales
método de filtración al vacío	0.45	0.35	La solución es transparente al final de la filtración, pero se vuelve turbia después de dejarla durante un período de tiempo.
método de microfiltración	0.45	0.42	La solución es transparente al final de la filtración y permanece clara después de dejarla por un período de tiempo.

 

Se puede ver en la tabla que tanto el método de filtración al vacío como el método de microfiltración pueden eliminar las impurezas y los sólidos insolubles en la solución, pero el método de microfiltración tiene un mejor efecto de protección sobre las proteínas, es decir, la pérdida no es significativa y el método de filtración al vacío puede provocar pérdidas de proteínas. Además, el filtrado queda turbio después de haber sido colocado durante un período de tiempo mediante filtración al vacío, mientras que la microfiltración aún es clara y transparente, por lo que se selecciona la microfiltración como proceso de pretratamiento de la ultrafiltración.

2.2 Prueba de factor único del proceso de ultrafiltración

2.2.1 Efecto de la presión de ultrafiltración sobre la tasa de retención

En condiciones de temperatura de 40 grados y pH de 9.0, estudie los efectos de diferentes presiones de ultrafiltración (0.07MPa, 0.{ {11}}9MPa, 0,11MPa, 0,13MPa y 0,15MPa) en la tasa de retención de proteínas. Los resultados se muestran en la siguiente figura.

 

Como puede verse en la figura anterior, con el aumento de la presión operativa, la tasa de interceptación de proteínas disminuyó gradualmente. A {{0}}.07 MPa, la tasa de retención de proteínas es del 96,53 %, cuando la presión de funcionamiento es de 0,15 MPa, la tasa de retención de proteínas es del 84,38 %. Esto se debe a que la separación de sustancias mediante ultrafiltración está impulsada por la diferencia de presión. En ese rango de baja presión operativa, las sustancias moleculares pequeñas pueden pasar rápidamente a través de la membrana, pero las sustancias macromoleculares pueden quedar atrapadas por la membrana de ultrafiltración y acumularse en la superficie de la membrana y, en este momento, la superficie de la membrana y el medio acuoso. extraer de la diferencia de concentración para causar resistencia a la polarización de la diferencia de concentración; sin embargo, con el aumento de la presión, la resistencia a la polarización de la concentración aumenta gradualmente y la diferencia de concentración entre la superficie de la membrana y el extracto acuoso alcanza el equilibrio. Cuando la presión excede este equilibrio, se podría escribir una capa de gel en la superficie de la membrana (lo que era consistente con la teoría de la polarización de la concentración y la capa de gel formada durante la ultrafiltración). La presión continúa aumentando, el grosor de la capa de gel aumenta y la proteína que permanece en la superficie de la membrana aumenta, lo que da como resultado una baja tasa de retención. Para garantizar el efecto de separación de la membrana, el parámetro de presión de funcionamiento óptimo es 0,07 MPa.

2.2.2 Efecto de la temperatura sobre la tasa de retención de proteínas

Bajo la condición de presión {{0}}.11 MPa, pH 9,0, estudie los efectos de diferentes temperaturas (25 grados, 30 grados, 35 grados, 40 grados y 45 grados) sobre la retención de proteínas. Los resultados se muestran en la siguiente figura.

 

Como se muestra en la figura anterior, con el aumento de la temperatura, la tasa de retención de la membrana de ultrafiltración aumenta gradualmente y alcanza el máximo a 45 grados, con una tasa de retención del 97,01%. Debido a que la viscosidad del colágeno está estrechamente relacionada con la temperatura: cuando la temperatura es más baja, la viscosidad del colágeno es mayor y, por lo tanto, es fácil que el colágeno forme resistencia en la superficie de la membrana, lo que resulta en una baja tasa de retención. Cuando aumenta la temperatura, la viscosidad del colágeno disminuye y la interacción entre las moléculas de colágeno se debilita, de modo que aumenta la tasa de transferencia de masa y se debilita la polarización de la concentración, aumentando así la tasa de retención. Otra razón para el aumento de la tasa de retención es que la temperatura aumenta y, en consecuencia, la solubilidad del colágeno aumenta y se reduce el fenómeno del bloqueo del colágeno de la membrana. Por tanto, la temperatura óptima para la ultrafiltración es de 45 grados.

2.2.3 Efecto del pH sobre la retención de proteínas

Bajo la condición de presión {{0}}.11MPa y temperatura 40 grados, estudie los efectos de diferentes condiciones de pH, a saber, pH=6.0, pH{ {5}}.{{10}}, pH=8.0, pH=9.0 y pH=10.0, sobre la tasa de retención. Los resultados se muestran en la siguiente figura.

 

As shown in the above figure, within the pH value range of 6–7, with the increase of pH value, the protein retention rate decreases, and there is a minimum value of 82.13% at pH=7.0. When pH>7, with the increase of pH value, the retention rate gradually increases. This is because the isoelectric point of collagen pH=7, at the isoelectric point of protein is a precipitation state, easy to stay on the surface of the membrane block membrane, so that the retention rate is low; When pH>7, la tasa de retención aumenta gradualmente con el aumento del pH. Esto se debe a que la membrana de ultrafiltración es una membrana de poliéter de arce con carga negativa, colágeno con carga negativa en condiciones alcalinas, las moléculas de colágeno cargadas negativamente y la membrana de ultrafiltración con la misma carga forman un estado mutuamente excluyente, por lo que no es fácil que las moléculas de colágeno permanezcan en la superficie. de la membrana, no es fácil bloquear la membrana, por lo que el pH óptimo de la ultrafiltración es 8-10.

2.3 Optimización del proceso de ultrafiltración y validación de resultados

El análisis realizado por el software Design-Expert8.05 muestra que los parámetros óptimos del proceso son los siguientes: presión de funcionamiento 0.14MPa, temperatura de funcionamiento 40,98 grados y pH de la solución=9.43. En estas condiciones, la tasa de retención fue del 92,551%. Teniendo en cuenta la operatividad de los parámetros reales, la presión de funcionamiento es de 0,14 MPa, la temperatura de funcionamiento es de 40 grados y el valor de pH del líquido de alimentación es de 9,50 en las condiciones de ultrafiltración. La verificación experimental se inicia después de que el sistema del dispositivo de ultrafiltración comienza a ser estable. El resultado de la tasa de retención obtenida es (92.61 0.1)% (n=3). El valor predicho de la ecuación es básicamente similar al valor medido, lo que indica que el resultado del parámetro condicional predicho está de acuerdo con el resultado condicional real.

2.4 Resultados del análisis de electroforesis

El colágeno purificado se analiza mediante electroforesis SDS-PAGE y los resultados se muestran en la siguiente figura.

Como se muestra en la figura anterior, el carril 1 es el colágeno purificado en este experimento y el carril 2 es la muestra de colágeno estándar del tendón de la pantorrilla. A partir de la electroforesis SDS-PAGE se pudo ver que la proteína de colágeno propuesta en este experimento podría identificarse como colágeno, pero los límites aparentemente indistintos de la cadena peptídica a1 y la cadena peptídica a2 no están claros. De la electroforesis se desprende claramente que no hay otras bandas de proteínas y se podría concluir que la pureza del colágeno purificado es alta.