Principios básicos y flujo de trabajo de la síntesis de péptidos en fase sólida-(SPPS)
Síntesis de péptidos-en fase sólida (SPPS)es un método para sintetizar péptidos sobre un soporte sólido. Las principales estrategias del SPPS incluyen lamétodo bocy elmétodo fmoc. La síntesis de péptidos es un proceso repetitivo de adición secuencial de aminoácidos y generalmente se lleva a cabo desde laC-terminal (extremo carboxilo)haciaN-terminal (extremo amino). Primero, el grupo carboxilo del primer aminoácido del péptido diana se une covalentemente a un soporte sólido (resina). Utilizando el grupo amino de este aminoácido como punto de partida, se elimina el grupo protector N-terminal y la cadena peptídica en crecimiento se alarga mediante reacción con un exceso de un segundo aminoácido activado. Este ciclo-acoplamiento → lavado → desprotección → neutralización y lavado → siguiente acoplamiento-se repite hasta lograr la longitud del péptido deseada. Finalmente, la cadena peptídica se escinde de la resina y se purifica para obtener el péptido diana. Cuando el grupo amino - está protegido conBoc (terc-butiloxicarbonilo), el método se conoce comoSíntesis de péptidos en fase sólida-basada en Boc-. Cuando el grupo amino - está protegido conFmoc (9-fluorenilmetiloxicarbonilo), se le conoce comoSíntesis de péptidos en fase sólida-basada en Fmoc-.
Síntesis de péptidos en fase sólida-basada en Boc-(método Boc)
En elmétodo boc, Grupos Boc eliminables mediante ácido trifluoroacético (TFA)se utilizan para proteger los -grupos amino, mientras quegrupos protectores tipo bencilo-se emplean para cadenas laterales. Durante la síntesis, un aminoácido -protegido con Boc-primero se une covalentemente a la resina. Luego se elimina el grupo Boc con TFA y el extremo amino libre resultante se neutraliza con trietilamina. El siguiente aminoácido se activa usandoDCC (diciclohexilcarbodiimida)y acoplados para extender la cadena peptídica. Después de completar el ensamblaje, el péptido objetivo se escinde de la resina usando un ácido fuerte, típicamentefluoruro de hidrógeno anhidro (HF)oácido trifluorometanosulfónico (TFMSA)En el método de síntesis de Boc, se requieren tratamientos ácidos repetidos para eliminar los grupos protectores antes de cada paso de acoplamiento. Esto puede provocar varias reacciones secundarias, como la escisión prematura del péptido de la resina y la inestabilidad de las cadenas laterales de aminoácidos en condiciones ácidas, lo que da lugar a reacciones secundarias no deseadas.
Síntesis de péptidos en fase sólida-basada en Fmoc-(método Fmoc)
En1978, Meienhofer y Athertondesarrolló una estrategia de síntesis de péptidos utilizandoFmoc (9-fluorenilmetiloxicarbonilo)como el grupo protector amino -, conocido comométodo fmoc. En este enfoque, el grupo amino - está protegido conbase-lábil Fmoc, mientras que las cadenas laterales están protegidas conGrupos protectores de tipo ácido-lábil Boc-.Una ventaja importante de Fmoc como grupo protector amino-es suestabilidad en condiciones ácidas; no se ve afectado por el tratamiento con reactivos comoácido trifluoroacético (TFA)y se puede eliminar selectivamente utilizandobase suave. Al mismo tiempo, los grupos protectores de cadena lateral- como Boc son estables en condiciones básicas y se eliminan mediante tratamiento ácido. Finalmente, el péptido se escinde cuantitativamente de la resina usandoTFA/diclorometano (DCM), evitando el uso de ácidos fuertes y mejorando así la seguridad y compatibilidad con la síntesis de péptidos de rutina.
Historia del desarrollo de la síntesis de péptidos en fase sólida-(SPPS)
1.Etapa fundacional (principios del siglo XX hasta 1963)
En1902, Emil FischerFue el primero en explorar la síntesis de péptidos, pero el progreso fue lento debido a limitaciones técnicas. Primeras síntesis empleadas.grupos protectores benzoilo y acetilo, que eran difíciles de eliminar y a menudo conducían aescisión de la cadena peptídica.
En1932, Max Bergmany compañeros-presentaron elgrupo benciloxicarbonilo (Z)como un -grupo protector amino. Este grupo podría eliminarse enhidrogenación catalítica o condiciones ácidas, proporcionando una herramienta más fiable para la síntesis de péptidos y sentando las bases para el desarrollo de la síntesis de péptidos en fase sólida-en la década de 1960.
durante el1950s, los científicos sintetizaron con éxito una variedad depéptidos biológicamente activos, comooxitocina e insulina. Estos logros hicieron avanzar aún más la química de los péptidos y sentaron las bases para el surgimiento de la síntesis de péptidos en fase sólida-.
2.Etapa pionera (1963)
En1963, Robert B. Merrifieldpropuso elMétodo de síntesis de péptidos en fase sólida-(SPPS), en el que elC-aminoácido terminalestá anclado a un soporte de resina, y la cadena peptídica se alarga a través de ciclos repetidos dedesprotección y acoplamiento. Este enfoque simplificó enormemente el proceso de síntesis de péptidos y se convirtió en elmétodo preferidopara el ensamblaje de péptidos.
Merrifield usadoBoc (terc-butiloxicarbonilo)para proteger el -grupo amino. A finales de la década de 1960, también desarrolló elprimer sintetizador de péptidos totalmente automatizadoy sintetizado exitosamenteproteínas biológicascomoribonucleasa (124 aminoácidos). Por estos logros innovadores, Merrifield recibió el premioPremio Nobel de Química en 1984.
3.Etapa de Innovación Tecnológica (1972)
En1972, Luis Carpinodesarrolló elGrupo protector 9-fluorenilmetiloxicarbonilo (Fmoc), que puede serEliminado suavemente en condiciones básicas., reduciendo las reacciones secundarias. Esto lo hizo especialmente adecuado parapéptidos complejosysíntesis automatizada.
Elmétodo fmocreemplazó gradualmente el método Boc como estrategia principal. Sintetizadores de péptidos automatizados basados en ambosQuímica de Fmoc y Bocfueron desarrollados posteriormente, impulsando elautomatización de la síntesis de péptidosy mejorando enormemente la eficiencia y reproducibilidad.
4.Etapa de madurez y expansión (década de 1990 a la actualidad)
Optimización de resinas y reactivos:Desarrollo deResinas modificadas con PEG-hidrófilo-de alta cargay reactivos de acoplamiento eficientes comoHBTUyHATUha mejorado significativamente la eficiencia y el rendimiento de la síntesis de péptidos en fase sólida-(SPPS).
Integración Tecnológica:Nuevos enfoques comosíntesis asistida por microondas-yquímica de flujohan acortado los tiempos de reacción y han aumentado aún más los rendimientos.
Principios básicos y flujo de trabajo de SPPS:
El principio básico de la síntesis de péptidos-en fase sólida es laconstrucción paso a paso de una cadena peptídica sobre un soporte sólido, usandoestrategias de grupo protectoryreacciones de condensación (acoplamiento)para lograrensamblaje de péptidos eficiente y controlable.
1.Papel del soporte sólido (resina) en la síntesis de péptidos en fase sólida-(SPPS)
A resina polimérica insoluble-comoresina reticulada de poliestireno-divinilbenceno-resina Wang o resina de amida Rink-se selecciona como soporte sólido en SPPS. La superficie de resina contienegrupos funcionales(p. ej., grupos hidroxilo o amino) que pueden formarenlaces covalentes con un extremo de la cadena peptídica, generalmente elC-terminal, anclando el péptido al soporte sólido. Esta unión covalente asegura que el péptido en crecimientopermanece unido a la resina durante toda la síntesis, que en gran medidaFacilita los pasos de reacción, lavado y purificación posteriores.
2.Protección de la estrategia de grupo en la síntesis de péptidos en fase sólida-(SPPS)
Durante la síntesis de péptidos, el-grupo amino, grupo carboxilo y grupos funcionales de cadena lateral-reactivade aminoácidos (como los grupos tiol, carboxilo y amino) son propensos areacciones secundarias. Para prevenir estas reacciones no deseadas,grupos protectoresse utilizan. Los grupos protectores comunes incluyen:-Grupos protectores de aminoácidos:
Boc (terc-butiloxicarbonilo):Ácido-lábil, se elimina fácilmente bajocondiciones ácidas.
Fmoc (9-fluorenilmetiloxicarbonilo):Estable en condiciones ácidas, se puede eliminar en condicionescondiciones basicas(p. ej., solución de piperidina/DMF).Grupos de protección de cadenas laterales-:Seleccionados según las propiedades químicas de la cadena lateral de aminoácidos. Los grupos comunes incluyenbencilo (Bn), terc-butilo (tBu), tritilo (Trt), etc. Estos grupos soneliminado al final de la síntesis, generalmente durante la escisión del péptido de la resina, usandoácido u otras condiciones específicas.
3.C-Síntesis de término a N-terminal en SPPS
EnSíntesis de péptidos en fase sólida-(SPPS), el ensamblaje de péptidos generalmente comienza en elC-terminal (extremo carboxilo)y avanza paso a paso hacia elN-terminal (extremo amino). Esto se debe a que elEl aminoácido C-terminal se une primero al soporte sólido., y los aminoácidos subsiguientes se acoplan algrupo amino libre de la cadena peptídica ya unido a la resina, alargando gradualmente la cadena peptídica.
4.Reacción de acoplamiento en síntesis de péptidos en fase sólida-(SPPS)
Los aminoácidos protegidos deben seractivadopara que susLos grupos carboxilo se vuelven reactivos., permitiéndoles formar unaenlace peptídicocon el grupo amino del péptido unido a la resina-. Comúnreactivos activadoresincluircarbodiimidas(p. ej., DCC, DIC),HOBt, HATU, yPyBOP. Una vez activado, el grupo carboxilo reacciona con el grupo amino libre en unareacción de condensación, formando unenlace amiday uniendo así el nuevo aminoácido a la cadena peptídica en crecimiento.
5.Operaciones repetitivas (cíclicas) en la síntesis de péptidos en fase sólida-(SPPS)
El proceso implicarepitiendo el ciclo de desprotección → acoplamiento → lavado, añadiendoun aminoácido por ciclopara alargar gradualmente la cadena peptídica. Después de cadareacción de acoplamiento, la resina eslavado(p. ej., con disolventes como DMF o DCM) para eliminar los reactivos que no han reaccionado, los subproductos y el exceso de aminoácidos. ElA continuación, se desprotege el -grupo amino del residuo recién añadido., exponiendo una amina libre para prepararse para la siguiente reacción de acoplamiento. Este ciclo se repite hasta que la secuencia peptídica deseada esté completamente ensamblada.
6.Escisión en síntesis de péptidos en fase sólida-(SPPS)
Una vez que la cadena peptídica ha alcanzado la longitud deseada, seescindido del soporte sólidoutilizando un reactivo apropiado, mientras que simultáneamenteeliminando todos los grupos protectores. Un reactivo de escisión comúnmente utilizado esácido trifluoroacético (TFA), que no sólorompe el enlace entre el péptido y la resinapero tambiénelimina los grupos protectorescomo Fmoc y Boc, restaurando el péptido a suestado nativo. Una vez que la cadena peptídica ha alcanzado la longitud deseada, seescindido del soporte sólidoutilizando un reactivo apropiado, mientras que simultáneamenteeliminando todos los grupos protectores. Un reactivo de escisión comúnmente utilizado esácido trifluoroacético (TFA), que no sólorompe el enlace entre el péptido y la resinapero tambiénelimina los grupos protectorescomo Fmoc y Boc, restaurando el péptido a suestado nativo.
A través de estos pasos,Síntesis de péptidos en fase sólida-(SPPS)permite elMontaje eficiente y controlado de cadenas peptídicas sobre un soporte sólido., evitando los complicados pasos de purificación intermedios requeridos en la síntesis tradicional en fase de solución-y significativamentemejorando la eficiencia y el rendimiento de la síntesis.
A través de estos pasos,Síntesis de péptidos en fase sólida-(SPPS)permite elMontaje eficiente y controlado de cadenas peptídicas sobre un soporte sólido., evitando los complicados pasos de purificación intermedios requeridos en la síntesis tradicional en fase de solución-y significativamentemejorando la eficiencia y el rendimiento de la síntesis.
