Proceso de concentración de ultrafiltración/diafiltración posterior: cómo prevenir eficazmente la permeación y pérdida de proteínas objetivo

Proceso de concentración de ultrafiltración/diafiltración aguas abajo: cómo prevenir eficazmente la permeación y pérdida de proteínas objetivo

En los procesos de purificación posteriores de proteínas recombinantes, productos sanguíneos y otros productos biológicos, la ultrafiltración/diafiltración (UF/DF) se utiliza para la concentración de materia prima, el intercambio de tampones y la eliminación de sales e impurezas de moléculas pequeñas-. La separación se logra mediante el tamizado de la membrana: las moléculas grandes, como los anticuerpos monoclonales (mAb), son retenidas por la membrana, mientras que las sales, las endotoxinas, las proteínas libres de la célula huésped (HCP) y otras impurezas de moléculas pequeñas- pasan a través de la membrana y se eliminan en el permeado. Durante el aumento de escala-del proceso, puede ocurrir fácilmente la pérdida de proteína objetivo a través de la membrana, lo que reduce directamente el rendimiento y aumenta los costos del lote. En algunas condiciones operativas, se pueden detectar proteínas en el permeado, lo que requiere una determinación rápida de si los componentes filtrados son mAb objetivo intactos, agregados degradados/fragmentados o proteínas de la célula huésped. Este artículo se divide en dos partes principales: revisa los enfoques de control de procesos-tradicionales y, en combinación con el diseño de experimentos (DOE), establece una ventana de proceso sólida, respaldada por múltiples métodos analíticos para determinar la identidad de las proteínas detectadas en el permeado.

 

 

I. Causas clave de la permeación de la proteína diana a través de la membrana durante la UF/DF

1. Presión transmembrana excesiva (TMP)
Cuando la diferencia de presión a través de la membrana es demasiado alta, aumenta la resistencia del disolvente, lo que obliga a que algo de proteína monomérica entre en el permeado. Durante el aumento de escala-, el tanque de alimentación contiene un mayor volumen de material y las fluctuaciones de presión en las tuberías son más pronunciadas, lo que hace que la sobrepresión transitoria sea más probable que a escala de laboratorio.

2. Caudal tangencial inadecuado
Si el caudal es demasiado bajo, se forma una densa capa de polarización de concentración-en la superficie de la membrana y la concentración de proteína local puede exceder el umbral de tolerancia de la membrana. Si el caudal es demasiado alto, la tensión de corte puede provocar la escisión estructural del mAb, generando fragmentos de proteína más pequeños que pueden pasar libremente a través de los poros de la membrana.

3. Concentración de proteínas excesivamente alta en la materia prima.
Cuando la concentración de proteína en el alimento es demasiado alta, la proteína se acumula en la superficie de la membrana y parte de la proteína monomérica puede ser transportada al permeado. Este es un problema común en la producción-a gran escala.

4. pH o conductividad fuera del rango del proceso
Los cambios en las características de carga de la proteína pueden reducir su radio de hidratación y el tamaño aparente de las partículas, lo que resulta en una permeación anormal de la membrana.

5. Envejecimiento del casete de membrana, alto flujo de difusión o pre-acondicionamiento insuficiente
Los defectos físicos en el casete de membrana pueden causar directamente fugas de proteínas y representar un riesgo relacionado con el equipo. La CIP repetida con soluciones fuertemente alcalinas puede dañar gradualmente el material de la membrana de polietersulfona (PES).

6. Volumen de diafiltración excesivo
Durante la diafiltración prolongada, el lavado continuo con disolvente puede eliminar gradualmente pequeñas cantidades de proteína monomérica.

 

II. Medidas prácticas tradicionales para prevenir la permeación y pérdida de proteínas objetivo

(A) Control de parámetros del proceso

1. Controlar la presión transmembrana (TMP)
Defina un límite de advertencia de presión superior y establezca alarmas de bloqueo para evitar impactos transitorios de alta-presión en la capa de membrana. Después de determinar los parámetros de referencia a pequeña escala, reduzca la presión operativa segura durante el aumento-de la producción y reserve un rango de tolerancia de proceso adecuado.

2. Optimice la tasa de flujo cruzado
Establezca una capa límite estable y reduzca la polarización de la concentración en la superficie de la membrana a través del flujo cruzado, minimizando así la acumulación de proteínas en la superficie de la membrana en la fuente.

3. Limitar la concentración final después de la concentración.
Definir un límite de concentración en función de las propiedades fisicoquímicas de la proteína y evitar una concentración excesiva del alimento. Para los mAb, la concentración final de rutina generalmente no excede los 50 mg/ml; para algunos mAb propensos a la agregación-, la concentración debe reducirse aún más.

4. Controlar el pH y la conductividad del alimento.
Mantenga un tamaño de partícula hidratado estable de la proteína y evite la contracción molecular causada por alteraciones de la fuerza ácido/base o{0}}iónica.

(B) Equipos y controles operativos

1. Realice pruebas de integridad del casete de membrana antes de cada lote.
Realice una prueba de punto de burbuja-antes de la producción de cada lote para identificar fibras de membrana rotas. Los casetes de membrana dañados deben desecharse inmediatamente para evitar la fuga continua de proteínas.

2. Estandarizar el procedimiento de limpieza CIP
Controlar la concentración de NaOH y el tiempo de contacto. Después de una limpieza fuertemente alcalina, equilibre completamente el material de la membrana para reducir el riesgo de deformación de los poros de la membrana.

3. Utilice diafiltración por etapas
Utilice un intercambio de tampón de gran-volumen durante la etapa inicial para eliminar las sales y reduzca la velocidad del flujo de diafiltración a medida que se acerca el punto final para reducir el arrastre y la pérdida de proteínas.

 

III. Establecimiento de un espacio de diseño de procesos a través de DOE (Caracterización de procesos QbD; aplicable a la presentación de IND)

1. Detección de factores
Evalúe cinco parámetros clave del proceso UF/DF (P): presión transmembrana, caudal de alimentación, concentración inicial de proteína, pH de la alimentación y temperatura de funcionamiento.
Variables de respuesta: rendimiento retenido, contenido de proteína en el permeado, flujo de membrana y porcentaje de agregados de alto-peso molecular-.

Mediante análisis de significancia, identifique los factores clave que contribuyen a la fuga de proteínas.

2. Modelado de superficie de respuesta
Seleccione los cuatro parámetros con mayor importancia para construir una superficie de respuesta y analizar las interacciones entre los parámetros. Bajo muchas condiciones operativas, un solo parámetro puede permanecer dentro de su rango calificado, mientras que la combinación de dos parámetros puede resultar en la permeación de proteínas. Estos efectos de interacción no se pueden identificar mediante experimentos tradicionales de un-factor-a-a-. Según el modelo, defina un espacio de diseño operable. Siempre que los parámetros del proceso permanezcan dentro de este rango, se puede garantizar una retención efectiva de proteínas mientras se eliminan las impurezas mediante diafiltración.

3. Desafío del peor-caso (requerido para la caracterización del proceso)
Seleccione los parámetros del proceso en los extremos de los límites operativos para simular la variabilidad de fabricación: TMP máximo, tasa de flujo cruzado mínima y{0}}límite superior de concentración de proteína. Verifique que incluso en condiciones operativas extremas, no se produzca una pérdida de proteína objetivo a gran-escala, cumpliendo así con los requisitos de revisión del CMC.

 

IV. Múltiples métodos analíticos para identificar proteínas detectadas en el permeado y distinguir mAb objetivo, fragmentos de degradación y HCP

Según los escenarios de eficiencia analítica, costo y presentación regulatoria, los métodos se pueden dividir en dos categorías: detección rápida y pruebas confirmatorias. Se debe dar prioridad a los métodos rápidos para el seguimiento rutinario de los procesos; cuando se producen desviaciones anormales, se deben utilizar métodos de identificación precisos.

1. Espectrofotometría UV (detección rápida en línea; preferida para el monitoreo de rutina del taller-)
Recoger el permeado y medir su absorbancia A280. Esto sólo puede determinar si hay proteínas presentes en el permeado y no puede distinguir las especies de proteínas. Se utiliza principalmente para el monitoreo de procesos de rutina. Un valor de A280 en continuo aumento indica un empeoramiento de la fuga de proteínas y requiere la suspensión inmediata de la diafiltración y la investigación del proceso.

2. Electroforesis SDS-PAGE (método de identificación cualitativa más utilizado)
Utilice electroforesis reductora y no-reductora y compare las posiciones de las bandas con las del mAb objetivo en la materia prima:
1) Si la posición de la banda es completamente consistente con el mAb objetivo, el mAb intacto ha permeado la membrana.
2) Si aparecen bandas de menor-peso molecular-, la proteína se ha sometido a una escisión hidrolítica, generando fragmentos de mAb.
3) Si las bandas están dispersas con varias bandas diversas, la mayoría son proteínas de la célula huésped (HCP) de células huésped de E. coli/CHO en lugar del producto objetivo.

3. Cromatografía de exclusión-de tamaño-de alto rendimiento (HPSEC)
Separe los componentes según el tamaño molecular y compare sus tiempos de elución con los del cromatograma de la materia prima:
- Un pico principal con el mismo tiempo de retención que el mAb indica una proteína objetivo intacta.
- Un pico que eluye antes indica agregados/fragmentos de alto peso-molecular-.
- Un pico que eluye más tarde indica fragmentos de degradación de bajo-peso molecular-.
- La ausencia de un pico principal característico indica proteínas de impureza HCP.
Este método puede proporcionar datos cuantitativos y puede incluirse en informes de investigación de desviaciones de procesos; tiene alta aceptación en materiales de presentación clínica.

4. Prueba del kit ELISA de proteína de la célula huésped-HCP
Si se detecta proteína en el permeado, el resultado de ELISA es elevado y HPSEC no muestra un pico de mAb característico, básicamente se puede determinar que el material filtrado son proteínas de la célula huésped-CHO. Esto indica una eliminación incompleta de impurezas durante la purificación aguas arriba; las impurezas se eliminan durante la etapa UF/DF y no representan pérdida de producto.

5. Verificación por cromatografía de afinidad (cromatografía de proteína A)
La proteína A se une específicamente a la región Fc de los mAb. Cargue la muestra de permeado en la columna: la aparición de un pico de elución característico indica la presencia de anticuerpo objetivo intacto; la ausencia de un pico de elución demuestra que todas las proteínas del permeado son proteínas impurezas.

6. Espectrometría de masas (LC-MS) (trazabilidad en-profundidad; utilizada para la investigación de desviaciones importantes del proceso)
LC-MS puede analizar directamente la secuencia de aminoácidos y determinar con precisión el origen de la proteína. Se utiliza principalmente para la investigación de desviaciones difíciles o inusuales y no se utiliza como rutina en-pruebas de control de procesos.

V. Acciones Correctivas Correspondientes a Diferentes Resultados Analíticos

1. AcM objetivo intacto detectado en el permeado
Reducir la presión transmembrana y la concentración final después de la concentración; reducir el rango operativo del proceso en función de los resultados del DOE; y comprobar la integridad del casete de membrana.

2. Fragmentos de degradación de anticuerpos detectados en el permeado.
Investigar la tensión de corte durante todo el proceso y los extremos del pH; optimizar el paso de inactivación viral aguas arriba para reducir la escisión de proteínas.

3. Sólo se detectan proteínas de impureza HCP en el permeado.
No se requiere ajuste de los parámetros UF/DF. Rastree el problema hasta los pasos de cromatografía anteriores y mejore la eliminación de impurezas durante la cromatografía de afinidad e intercambio iónico-.

 

VI. Resumen

Para evitar la fuga de proteínas durante la UF/DF, el control de procesos tradicional se basa en la experiencia histórica para definir parámetros puntuales individuales, que solo pueden abordar adecuadamente la producción estable a pequeña escala-. Para garantizar un rendimiento estable durante la ampliación gradual del proceso-, se debe utilizar una caracterización de procesos basada en DOE- para establecer un espacio de diseño de procesos con suficiente tolerancia. El control de parámetros basado en intervalos- puede compensar la variabilidad de fabricación. Una vez que se detecta proteína en el permeado, un simple sistema de detección UV puede proporcionar una advertencia inicial, seguida de electroforesis, HPSEC y ELISA para trazabilidad e identificación. Esto permite una diferenciación precisa entre el producto objetivo y las impurezas de las células-huésped, lo que permite investigar la causa raíz-y tomar medidas correctivas. Este también es un componente de investigación estandarizado que actualmente se incluye en la documentación de CMC para proyectos de mAb.