Vacuna de partículas similar a un virus y su proceso de purificación aguas abajo

La vacuna de partículas similares a virus (VLP) es una tecnología de vacuna basada en la estructura del virus pero no contiene los materiales genéticos virales. Estimulan una fuerte respuesta inmune al imitar la morfología y los antígenos superficiales de los virus naturales, y proporcionan una mayor seguridad debido a su incapacidad para replicarse. Las vacunas VLP son una mejor alternativa a las vacunas tradicionales (vivas atenuadas e inactivadas). La vacuna VLP no puede replicarse en el cuerpo, por lo que es adecuado para todos, incluidas las mujeres embarazadas o aquellas con sistemas inmunes comprometidos. Además, las proteínas de la cápside (incluidas otras proteínas estructurales) de los virus con genomas segmentados, como los virus de la influenza, los virus de las enfermedades de los caballos africanos y los virus de la canción blueTongue, también pueden usarse para desarrollar vacunas VLP sin preocuparse por problemas de recombinación genética como vacunas vidas atenuadas. En segundo lugar, los VLP pueden imitar la estructura de los virus reales, a diferencia de las vacunas inactivadas, cuyas proteínas estructurales pueden modificarse durante la inactivación, lo que resulta en un deterioro inmunogénico.

 

HIGO. 1. Mecanismo de formación de VLP y VLP quiméricos

 

Características de la vacuna VLP

1. Estructura similar a los virus naturales: los VLP se autoensamblan por una o más proteínas estructurales (como las proteínas de la cápside), y su tamaño y forma son similares a los virus reales.

2. No infeccioso: no contiene el genoma viral, no puede replicar o causar enfermedades.

3. Alta inmunogenicidad: la estructura granular puede ser reconocida por el sistema inmune de manera eficiente y activar las respuestas de células B y células T. Puede inducir anticuerpos neutralizantes e inmunidad celular (por ejemplo, VIH, vacunas contra el VPH).

4. Alta seguridad: adecuada para personas con baja función inmune (como la vacuna contra la hepatitis B VLP).

 

HIGO. 2. Vaccinas VLP disponibles

 

Sistema de producción de vacunas VLP

Los VLP se pueden producir a través de una variedad de sistemas de expresión, las plataformas comunes incluyen:

 

1. Sistema de baculovirus de células de insecto:

Ventajas: alto rendimiento, bajo costo, adecuado para el ensamblaje de proteínas complejas.

Aplicación: vacuna contra el VPH, vacuna contra el ébola.

 

2. Células de mamíferos (por ejemplo, células HEK293):

Ventajas: las modificaciones postraduccionales están más cerca de los humanos y son adecuadas para VLP envueltos (como las vacunas contra la gripe).

 

3. Sistemas de levadura (por ejemplo, Pichia pastoris):

Ventajas: rápido, bajo costo, se ha utilizado en la vacuna contra la hepatitis B.

 

4. Sistemas de plantas (por ejemplo, cloroplastos de tabaco):

Ambientalmente amigable y escalable, en desarrollo (por ejemplo, vacuna contra VLP de norovirus).

 

Proceso de purificación aguas abajo de la vacuna VLP

La diversidad de los sistemas de expresión de VLPS conduce a la inuniversidad de los procesos de purificación aguas abajo.

 

 

HIGO. 3 Un diagrama general de flujo de proceso aguas abajo

 

Cosecha y aclaración:

En todo tipo de medio de cultivo, que se propina por el cultivo celular, hay una gran cantidad de partículas de virus, así como en muchos restos de tejido celular, productos metabólicos y otras impurezas, lo que hace que el medio de cultivo nublado o semi-nube, si se concentra el medio de cultivo directamente, la membrana ultrafiltración se bloqueará, el resultado no se puede completar y la concentración y la membrana ultrafiltración es la membrana. Por lo tanto, debe aclararse en primer lugar antes de la concentración, eliminar las partículas grandes en el medio de cultivo, de modo que se convierta en una solución transparente o transparente, y la concentración del medio de cultivo puede hacer que el proceso de concentración sea normal y garantizar la vida útil de la membrana de ultrafiltración. La aclaración antes de la concentración de la solución de cultivo es un enlace técnico clave en el proceso de concentración.

 

Un proceso de aclaración eficiente requiere una combinación de alta capacidad para eliminar partículas sólidas, alto rendimiento del producto, fácil escala y protección a las unidades operativas aguas abajo.

 

Método

Centrifugación: la centrifugación diferencial elimina las partículas grandes.

Filtración profunda: use un filtro de varias etapas (por ejemplo, 1.2μm → 0. 45μm) para aclarar el sobrenadante.

Filtración de flujo tangencial (TFF): adecuado para la producción en masa, concentra muestras y elimina pequeñas partículas de impurezas.

 

Sin embargo, si la escala de cultivo es demasiado grande, la centrifugación lleva mucho tiempo, se requerirá una gran cantidad de membranas de filtro profundo, por lo que el costo de los consumibles aumenta enormemente. Al mismo tiempo, la alta densidad del cultivo celular reducirá la carga de la membrana del filtro profundo, lo que resulta en mayores costos y la dilución excesiva del producto.

 

Hay dos tipos de componentes de membrana TFF: casete plano y fibra hueca. La filtración de flujo tangencial (TFF) es impulsada por la diferencia de presión transmembrana. Sustancias e impurezas que son más pequeñas que el poro de la membrana pasan a través de la membrana, mientras que las impurezas como las células con partículas más grandes están atrapadas. El tamaño de poro de la membrana utilizada para la microfiltración es {{0}}. 45/0.22 μm. La fibra hueca puede procesar un alto contenido sólido líquido directamente, como el medio de cultivo celular de alta densidad, puede eliminar los pasos de centrifugación y prefiltración, menos pasos, operación simple, membrana se pueden usar repetidamente mediante la limpieza, la reducción de la inversión de equipos y los costos operativos, en línea con los requisitos de producción automatizada modular.

 

Concentración de ultrafiltración (TFF):

Objetivo: para reducir la cantidad de tratamiento cromatográfico, mejorar la eficiencia cromatográfica y proteger la columna cromatográfica.

En general, la ultrafiltración (TFF) puede concentrarse más de 100 veces de VLP, y la tasa de eliminación de heteroproteína puede alcanzar el 99%. Entre ellos, la tecnología de filtración de membrana de fibra hueca tiene las ventajas de la fuerza de corte leve y baja, no es fácil de enchufar, operación flexible, larga vida útil, bajo costo y amplificación fácil, por lo que se recomienda elegir fibra hueca para VLP concentrado y purificado.

 

Cuando se usa el método de ultrafiltración para la concentración y la purificación, es muy importante seleccionar el tamaño de poro de membrana correcto, lo que determina la eficiencia y la calidad de la concentración directamente. Por un lado, es necesario seleccionar la abertura de la membrana para atrapar efectivamente las moléculas objetivo para garantizar el rendimiento y, por otro lado, el efecto de eliminación y la velocidad de procesamiento de las heteroproteínas deben considerarse completamente. Por lo tanto, el mejor principio es seleccionar la membrana con el tamaño de poro más grande que puede atrapar la molécula objetivo e intentar seleccionar la membrana del filtro con una distribución de tamaño de poro uniforme.

 

Purificación primaria:

1. Método de precipitación

Precipitación de polietilenglicol (PEG): la precipitación selectiva de VLP requiere concentración optimizada de PEG y concentración de sal para equilibrar el rendimiento y la pureza.

 

2. Cromatografía

Cromatografía de afinidad:

Afinidad de la heparina: utilizando las propiedades VLPS de la carga negativa de la superficie (p. Ej., VLP de HPV).

Cromatografía de acoplamiento de anticuerpos: alta especificidad pero costosa.

Cromatografía de intercambio iónico (IEX): elija el intercambio de aniones (p. Ej., Q columna) o intercambio de cationes (EG, columna SP) dependiendo de las características de carga de la superficie VLP y optimice el gradiente de pH y sal para evitar la agregación de partículas.

Cromatografía de interacción hidrofóbica (HIC): basada en la hidrofobicidad de la superficie VLP, adecuada para algunos VLP no encapsulados.

 

Purificación fina:

Cromatografía de exclusión molecular (SEC, filtración de gel):

Eliminación de proteínas huésped residuales, ácidos nucleicos o agregados, acompañados de reemplazo del tampón. Alta resolución pero bajo flujo, a menudo utilizado como el paso final de refinamiento.

 

Cromatografía en modo múltiple:

Por ejemplo, las resinas de la serie Capto Core, combinadas con el intercambio iónico y el efecto de tamiz molecular, pueden eliminar una variedad de impurezas en un solo paso.

 

Inactivación del virus/eliminación de ácido nucleico (si es necesario):

Tratamientos de nucleasa: como la benzonasa degradan el ADN del huésped/ARN.

UF/DF: coordinar el sistema TFF para eliminar pequeños fragmentos de ácidos y enzimas nucleicas.

 

Concentración y preparación:

Filtración de flujo tangencial (TFF):

Concéntrese en títulos objetivo mientras desplazan tampones (como PBS o tampones de formulación).

 

Filtración estéril:

0. 22 μm de filtración de membrana asegura la esterilidad.

 

Caso típico

Los siguientes son los procesos de purificación aguas abajo para las vacunas VLP típicas.

 

 

Acerca de la orientación

La tecnología de orientación es una empresa de alta tecnología orientada a la producción y que se centra en la aclaración, separación y purificación posteriores de los biofarmacéuticos. Los productos se utilizan ampliamente en el proceso de filtración de mAb, vacuna, diagnóstico, productos sanguíneos, suero, endotoxina y otros productos biológicos; Guyling Technology tiene "Filtro de casetes y dispositivo de filtración de flujo tangencial", "membrana de fibra hueca", "filtro de virus", "membrana profunda", "filtro de esterilizaation", "dispositivos de filtro centrífugo" y otros productos, y tiene una gran cantidad de líneas de productos, desde pequeños filtraciones de filtración de laboratorio hasta el sistema de filtración de producción, satisfacer las necesidades de pruebas y producción. ¡La orientación de la tecnología espera cooperar con usted!