Aplicación de la ultrafiltración en la extracción de colágeno natural.

El colágeno, como recurso proteico natural, tiene buena biocompatibilidad, baja antigenicidad, biodegradabilidad y hemostasia, su estrecha estructura helicoidal y sus propias características, todo lo cual proporciona requisitos previos para su industrialización. El colágeno y sus subproductos no sólo se utilizan como materiales de embalaje, cosméticos y productos para el cuidado de la salud, sino también como aditivos alimentarios para mejorar el producto cárnico, y desempeña un papel importante, especialmente en el campo médico.

 

¿Qué es el colágeno??

 

El colágeno es una macromolécula biológica, el componente principal del tejido conectivo animal y la proteína funcional más abundante y ampliamente distribuida en los mamíferos, representando del 25% al ​​30% de la proteína total, e incluso hasta el 80% o más en algunos organismos. Desempeña el papel de unión del tejido en las células animales.

Se mide que el cuerpo de un adulto tiene alrededor de 3 kg de colágeno, que existe principalmente en la piel humana, huesos, ojos, dientes, tendones, órganos internos (incluidos el corazón, el estómago, los intestinos, los vasos sanguíneos) y otras partes del cuerpo humano, y su Su función es mantener la morfología y estructura de la piel, los tejidos y órganos, y también es una materia prima importante para la reparación de diversos tejidos después de una lesión.

 

Hay muchos tipos de proteínas de colágeno y los tipos comunes son el tipo I, el tipo II, el tipo III, el tipo V y el XI. Debido a su buena biocompatibilidad, biodegradabilidad y bioactividad, el colágeno se ha utilizado ampliamente en alimentos, medicina, ingeniería de tejidos, cosméticos y otros campos.

Cómo extraer colágeno natural

Los tejidos animales de ganado y aves de corral son la principal vía para que las personas obtengan colágeno natural y sus péptidos de colágeno. Sin embargo, debido a enfermedades animales relacionadas y ciertas creencias religiosas, el uso humano del colágeno y sus productos de mamíferos terrestres es limitado, y el desarrollo se está dirigiendo gradualmente a los organismos marinos. La Autoridad Europea de Seguridad Alimentaria (EFSA) ha confirmado que incluso el colágeno derivado de huesos de animales no tiene el potencial de infectar la enfermedad de las vacas locas y otras enfermedades relacionadas. Debido a las diferencias en la composición de aminoácidos y el grado de reticulación, los animales acuáticos, especialmente el colágeno rico en sus desechos de procesamiento, como la piel, los huesos y las escamas, tienen muchas ventajas que el colágeno del ganado no tiene. Además, el colágeno derivado de animales marinos es obviamente superior al colágeno de animales terrestres en algunos aspectos, como su baja antigenicidad e hipoalergenicidad. Por lo tanto, el colágeno acuático puede reemplazar gradualmente al colágeno de los animales terrestres. Se tomó como ejemplo el proceso de extracción de colágeno de las escamas de la carpa herbívora.

 

Extracción de colágeno de escamas de carpa herbívora mediante el método de ultrafiltración.

1. Materiales y métodos

1.1 Muestra de prueba

Extracto acuoso de colágeno crudo.

1.2 Métodos de prueba

1.2.1 Ruta del proceso de ultrafiltración

 

1.2.2 Determinación del proceso de prefiltración

En esta prueba, se comparan y analizan el método de filtración al vacío y el método de microfiltración para determinar el mejor proceso de filtración previa a la filtración. Los métodos de prueba específicos son los siguientes:

① El extracto acuoso de colágeno crudo se filtró mediante bombeo al vacío de papel de filtro para eliminar las partículas suspendidas y las impurezas en el extracto acuoso.

② El extracto acuoso de colágeno crudo se filtró mediante una membrana de microfiltración de 0.2 μm para eliminar la materia insoluble y las impurezas del extracto acuoso.

 

1.2.3 Selección del tamaño de poro de la membrana de ultrafiltración

El tamaño de poro de la membrana de ultrafiltración fue de 100 kDa.

 

1.2.4 Experimento de factor único del proceso de purificación por ultrafiltración.

Se utilizó tecnología de ultrafiltración para purificar el extracto acuoso de colágeno crudo y se estudiaron experimentos de factor único sobre los efectos de la presión operativa, la temperatura operativa y el valor del pH en la retención de colágeno. Después de poner en marcha y estabilizar el equipo de ultrafiltración durante un período de tiempo, se estudió la influencia de varios factores en la retención de colágeno.

 

1.2.5 Fórmula de cálculo

 

2. Resultados y análisis

2.1 Resultados del análisis del proceso de prefiltración.

Los resultados de la comparación de los dos métodos de filtración de extracción al vacío y microfiltración se muestran en la siguiente tabla.

 

Se puede ver en la tabla que tanto el método de filtración al vacío como el método de microfiltración pueden eliminar impurezas y sólidos insolubles en la solución, pero el método de microfiltración tiene un mejor efecto protector sobre las proteínas, es decir, la pérdida no es obvia y el método de filtración al vacío sí. Es fácil provocar pérdida de proteínas. Además, el método de filtración al vacío aparece turbidez después de que el filtrado se coloca durante un período de tiempo, y el microfiltrado aún es claro y transparente, por lo que se elige la microfiltración como el proceso de pretratamiento de la ultrafiltración.

 

2.2 Prueba de factor único del proceso de ultrafiltración

2.2.1 Influencia de la presión de ultrafiltración en la tasa de retención

Bajo la condición de temperatura de 40 grados y pH=9.0, la influencia de diferentes presiones de ultrafiltración (0.07MPa, {{9} }.09MPa, 0,11MPa, 0,13MPa y 0,15MPa) sobre la retención de proteínas. Los resultados se muestran en la siguiente figura.

Como puede verse en la figura anterior, con el aumento de la presión operativa, la tasa de retención de proteínas disminuye gradualmente. Cuando la presión de funcionamiento es {{0}}.07 MPa, la tasa de retención de proteínas es del 96,53 % y cuando la presión de funcionamiento es de 0,15 MPa, la tasa de retención de proteínas es del 84,38 %. Esto se debe a que el efecto de separación de la ultrafiltración de sustancias se lleva a cabo por la diferencia de presión. En el rango de baja presión de funcionamiento, las moléculas pequeñas pueden pasar rápidamente a través de la membrana, mientras que las moléculas grandes pueden quedar atrapadas por la membrana de ultrafiltración y acumularse en la superficie de la membrana. En este momento, la superficie de la membrana y el extracto acuoso forman una diferencia de concentración, lo que resulta en la resistencia a la polarización de la concentración. En este momento, la presión es relativamente baja y no puede tener un gran impacto en la tasa de retención. Sin embargo, con el aumento de la presión, la resistencia a la polarización de la concentración aumenta gradualmente y la diferencia de concentración entre la superficie de la membrana y el extracto acuoso alcanza el equilibrio. Cuando la presión excede este equilibrio, se puede formar una capa de gel en la superficie de la membrana (lo cual es consistente con la teoría de que durante la ultrafiltración se forman polarización de concentración y una capa de condensación), y la presión continúa aumentando, el espesor de la capa de gel aumenta. , y la proteína que queda en la superficie de la membrana también aumenta. Esto da como resultado una tasa de retención más baja. Para garantizar el efecto de separación de la membrana, el parámetro óptimo de presión de funcionamiento es 0,07 MPa.

 

2.2.2 Influencia de la temperatura en la retención de proteínas

Bajo las condiciones de {{0}}.11MPa de presión y pH=9.0, los efectos de diferentes temperaturas, a saber, 25 grados, 30 grados, 35 grados, 40 grados y 45 grados, sobre las proteínas Se estudió la retención. Los resultados se muestran en la siguiente figura.

Como se puede ver en la figura anterior, la tasa de retención de la membrana de ultrafiltración aumenta gradualmente con el aumento de la temperatura y alcanza el máximo a 45 grados, con una tasa de retención del 97,01%. Esto se debe a que la viscosidad del colágeno está estrechamente relacionada con la temperatura. Cuando la temperatura es baja, la viscosidad del colágeno es mayor y la acumulación de colágeno en la superficie de la membrana es fácil de formar resistencia, lo que resulta en una baja tasa de retención. Cuando aumenta la temperatura, la viscosidad del colágeno disminuye, la interacción entre las moléculas de colágeno se debilita y la tasa de transferencia de masa aumenta, el fenómeno de polarización de la concentración se debilita y la tasa de retención aumenta. Otra razón para el aumento de la tasa de retención es que la temperatura aumenta, la solubilidad del colágeno también aumenta correspondientemente y el fenómeno del colágeno que bloquea la membrana se reduce, por lo que la temperatura óptima de ultrafiltración es de 45 grados.

 

2.2.3 Influencia del valor del pH en la retención de proteínas

En condiciones de {{0}}.11MPa de presión y 40 grados de temperatura, la influencia de diferentes condiciones de pH, a saber, pH=6.0, pH{{ 5}}.{{10}}, pH=8.0, pH=9.0 y pH=10.0, sobre la tasa de retención. Los resultados se muestran en la siguiente figura.

 

As can be seen from the figure above, in the range of pH 6-7, the protein retention rate decreases with the increase of pH value, and the minimum value is 82.13% when pH=7.0; when pH>7, the retention rate gradually increases with the increase of pH value. This is because the isoelectric point of collagen is pH=7. At the isoelectric point, the protein is in a state of precipitation, which is easy to stay on the surface of the membrane and block the membrane, thus reducing the retention rate. When pH>7, la tasa de retención aumenta gradualmente con el aumento del valor del pH. Esto se debe a que la membrana de ultrafiltración es una membrana de poliéter de arce con carga negativa y el colágeno tiene carga negativa en condiciones alcalinas. Las moléculas de colágeno cargadas negativamente forman un estado mutuamente excluyente con la membrana de ultrafiltración con la misma carga, por lo que no es fácil que las moléculas de colágeno permanezcan en la superficie de la membrana y bloqueen la membrana. Por tanto, el valor de pH óptimo de la ultrafiltración es 8-10.

 

2.3 Optimización del proceso de ultrafiltración y verificación de resultados.

Según el análisis del software Design-Expert8.05, los parámetros óptimos del proceso son: presión de funcionamiento 0.14MPa, temperatura de funcionamiento 40.98 grados, pH de la solución{{7 }}.43, y la tasa de retención es del 92,551%. Teniendo en cuenta la operatividad de los parámetros reales, las condiciones de ultrafiltración se seleccionaron como presión de funcionamiento de 0,14 MPa, temperatura de funcionamiento de 40 grados y valor de pH de 9,50 de la solución del material, y la verificación de la prueba se inició después de que se puso en marcha y se estabilizó el sistema de ultrafiltración. El resultado de la tasa de retención fue (92,61±0,1) % (n=3). Los valores predichos de la ecuación son básicamente similares a los valores medidos, lo que muestra que los resultados de los parámetros de condición predichos concuerdan con los resultados de la condición real.

 

2.4 Resultados del análisis electroforético

El colágeno purificado se analizó mediante electroforesis SDS-PAGE y los resultados se muestran en la siguiente figura.

 

Como puede verse en la figura anterior, el carril 1 es el colágeno purificado de esta prueba y el carril 2 es la muestra de colágeno estándar del tendón de la pantorrilla. A partir de la electroforesis SDS-PAGE se puede ver que el colágeno en este estudio puede identificarse como colágeno, pero los límites entre la cadena peptídica a1 y la cadena peptídica a2 parecen no estar claros. Se puede ver en el mapa electroforético que no hay otra impureza proteica, por lo que se puede concluir que el colágeno purificado tiene una alta pureza.

Acerca de Guidling

 

Guidling Technology es una empresa nacional de alta tecnología que se centra en productos biofarmacéuticos, cultivo celular, purificación y concentración de biomedicina, diagnóstico y fluidos industriales. Hemos desarrollado con éxito dispositivos de filtrado centrífugo, casetes de ultrafiltración y microfiltración, filtros de virus, sistemas TFF, filtros de profundidad, fibras huecas, etc. que satisfacen completamente los escenarios de aplicación de productos biofarmacéuticos, cultivos celulares, etc. Nuestras membranas y filtros de membrana se utilizan ampliamente en concentración, extracción y separación de prefiltración, microfiltración, ultrafiltración y nanofiltración. Nuestras numerosas líneas de productos, desde filtración de laboratorio pequeña y de un solo uso hasta sistemas de filtración de producción, pruebas de esterilidad, fermentación, cultivo celular y más, satisfacen las necesidades de prueba y producción. ¡Guidling Technology espera cooperar con usted!