Proceso de purificación a escala industrial-para la vacuna contra la rinotraqueítis infecciosa bovina (IBR): sección "Ultrafiltración"
La rinotraqueítis infecciosa bovina (IBR) es causada por una infección con el virus de la rinotraqueítis infecciosa bovina (IBRV), también conocido como herpesvirus bovino tipo 1 (BHV-1). La enfermedad se caracteriza principalmente por síntomas respiratorios y aborto. Además de estas manifestaciones clínicas, la IBR puede provocar una reducción de la producción de leche en el ganado lechero y una disminución del aumento de peso en el ganado de carne, lo que genera importantes pérdidas económicas para las explotaciones ganaderas.
La enfermedad es de naturaleza inmunosupresora. Cuando ocurre como una infección única, su patogenicidad es relativamente baja; sin embargo, cuando ocurren infecciones mixtas con otras enfermedades virales o bacterianas, la gravedad y el daño aumentan significativamente. La vacunación es el método más eficaz de prevención y control, existiendo dos tipos principales de vacunas disponibles: vacunas vivas atenuadas y vacunas inactivadas. En la actualidad, las vacunas contra la rinotraqueitis infecciosa bovina que se utilizan en las granjas son predominantemente vacunas inactivadas.
Las vacunas vivas atenuadas se caracterizan por una fuerte inmunogenicidad, un rápido inicio de la inmunidad y una protección de larga duración (normalmente más de seis meses). Se utilizan comúnmente para la inmunización de emergencia durante brotes de enfermedades. Sin embargo, conllevan riesgos potenciales de diseminación de virus, plantean riesgos para las vacas preñadas y no pueden usarse en ganado con infección latente pero asintomático.
Las vacunas inactivadas se caracterizan por su alta seguridad, sin riesgo de diseminación del virus o de reversión a la virulencia, y se consideran absolutamente seguras. Se pueden utilizar en ganado en todas las etapas, incluidas vacas preñadas, terneros y toros reproductores. Sin embargo, el inicio de la inmunidad es relativamente lento y la duración de la protección es más corta, por lo que normalmente se requieren vacunas de refuerzo. En algunos casos, la eficacia protectora puede ser más débil que la de las vacunas vivas atenuadas.
Independientemente de si se utiliza una vacuna viva atenuada o una vacuna inactivada, el proceso de purificación posterior se puede dividir en cuatro etapas principales: recolección y clarificación → concentración y purificación primaria → purificación de pulido → inactivación/filtración estéril y formulación.
La concentración es un paso fundamental en el proceso de purificación posterior de las vacunas, inmediatamente después de la clarificación. Su objetivo principal es reducir rápidamente la solución clarificada de virus de gran-volumen y baja-concentración recolectada a una forma de pequeño-volumen y alta-concentración manteniendo al mismo tiempo la bioactividad viral. Esto crea las condiciones necesarias para pasos posteriores de purificación fina de alta-resolución pero baja-capacidad, como la cromatografía.
Este paso normalmente se lleva a cabo mediante ultrafiltración de flujo tangencial (TFF). El principio es el siguiente: la solución de alimentación viral fluye paralela a la superficie de una membrana de ultrafiltración con un tamaño de poro específico. Bajo presión, pequeñas moléculas como agua, sales y ciertas impurezas pasan perpendicularmente a través de la membrana y se eliminan, mientras que las partículas de virus intactas, que son mucho más grandes que los poros de la membrana, se retienen, se recirculan continuamente y se concentran. En comparación con la centrifugación tradicional de alta-velocidad, este método es más suave para virus frágiles como el IBRV, que tienen una envoltura lipídica. Reduce eficazmente el daño estructural del virus y la pérdida de actividad causada por altas fuerzas de corte y es más susceptible de ampliación lineal-para la producción industrial.
Una operación de concentración exitosa es mucho más que simplemente reducir el volumen. Los puntos clave para la optimización del proceso incluyen: controlar con precisión la presión transmembrana y el caudal de alimentación para equilibrar la eficiencia de la filtración y al mismo tiempo minimizar la polarización de la concentración y la contaminación de la membrana; seleccionar el material de membrana y el tamaño de poro adecuados para garantizar una alta retención de virus y un flujo de permeado; y encontrar el equilibrio óptimo entre la recuperación del virus, el factor de concentración y el tiempo de procesamiento. La suspensión viral concentrada no solo logra un título significativamente más alto sino que también logra una purificación preliminar al eliminar una gran porción de impurezas solubles en agua-. Esto proporciona la base necesaria de volumen y concentración para los pasos de refinamiento críticos posteriores, como la cromatografía y el tratamiento con nucleasa, lo que convierte a la concentración en un centro central de eficiencia en todo el proceso posterior.
La diafiltración secundaria es un paso crítico en la purificación posterior de la vacuna, ubicada después de la purificación fina y antes de la formulación. Normalmente se lleva a cabo después de un tratamiento con cromatografía y nucleasa. Su objetivo principal no es la concentración inicial, sino el intercambio de sistemas y el ajuste preciso de las condiciones de formulación final. El proceso se realiza en un sistema de ultrafiltración de flujo tangencial (TFF), donde se agrega continuamente un tampón de formulación limpio y nuevo a la solución viral concentrada en circulación, mientras se eliminan el solvente original y las impurezas de las moléculas pequeñas-. Esta operación elimina eficaz y suavemente las sales residuales, disolventes orgánicos, productos de degradación de nucleasas y trazas de impurezas solubles que quedan del proceso de purificación.
La clave es mantener un volumen constante o aplicar ajustes menores de concentración para garantizar que la concentración del virus cumpla con las especificaciones de la formulación. Para virus frágiles y envueltos, como el virus de la rinotraqueítis infecciosa bovina (IBRV), el ambiente hidrodinámico suave de la diafiltración secundaria es crucial para preservar la integridad y la inmunogenicidad de las partículas. En última instancia, este paso proporciona una base sólida para la inactivación posterior (si es necesaria), la adición de adyuvante o estabilizador y el llenado final, asegurando que el producto final ingrese a la formulación con componentes definidos, condiciones uniformes y buena compatibilidad. Por lo tanto, es uno de los pasos principales para garantizar la seguridad, la estabilidad y la coherencia entre lotes-de-lotes.
El IBRV es un virus de ADN lineal bicatenario-envuelto con una envoltura aproximadamente esférica. Las partículas maduras de IBRV tienen un diámetro de aproximadamente 160 a 230 nm. En consecuencia, el uso de membranas de ultrafiltración de 100, 300 o 500 kDa puede retener el IBRV y al mismo tiempo eliminar algunas proteínas contaminantes. La tasa de recuperación de ultrafiltración de los casetes de membrana de Jiuling Technology varía según el tipo de material de alimentación, pero generalmente alcanza entre el 90% y el 95%.