Breve discusión sobre varios métodos únicos de fibra hueca en la purificación de cuerpos de inclusión
Los cuerpos de inclusión (IB) son partículas proteicas insolubles de alta densidad envueltas en membranas que se forman cuando se expresan genes extraños en células procarióticas, especialmente en Escherichia coli. Cuando se observa bajo un microscopio, IB es una región de alta refracción, que obviamente es diferente de otros componentes del citoplasma.
La formación de cuerpos de inclusión es relativamente compleja, está relacionada con la tasa de producción de proteínas en el citoplasma, la concentración de péptidos recién generados es alta y no hay tiempo suficiente para plegarse para formar agregados de proteínas amorfas. Los cuerpos de inclusión están compuestos básicamente por proteínas, de las cuales más del 50% son productos clonados. La estructura primaria de estos productos es completamente correcta, pero la configuración tridimensional es errónea, por lo que no existe actividad biológica. El tamaño del cuerpo de inclusión es 0,5-1μm, insoluble en agua, solo soluble en desnaturalizantes como urea, clorhidrato de guanidina, etc.
En E. coli, los cuerpos de inclusión pueden aparecer en dos ubicaciones de la célula: citoplasma y citoplasma periférico. La ubicación y características de los cuerpos de inclusión en la célula dependen de cómo se expresan las proteínas.
Las inclusiones en el citoplasma de E. coli generalmente varían en diámetro de {{0}}.2 a 1,5 μm, y diferentes proteínas tienen diferentes diámetros, como el tamaño del interferón es de 0,811 μm y el tamaño de El prorennet es de 1,281 μm. En algunos casos, el diámetro de algunos cuerpos de inclusión es mayor que el diámetro de E. coli, lo que le da a E. coli una protuberancia. En general, una célula tiene un solo cuerpo de inclusión.
Purificación del cuerpo de inclusión
El proceso de purificación de cuerpos de inclusión generalmente es:
Trituración de células:
La tecnología general de trituración de células es: trituración de tejido a alta velocidad, homogeneización con homogeneizador de vidrio, tratamiento ultrasónico, método repetido de congelación y descongelación, tratamiento químico (generalmente mediante tratamiento con lisozima).
Inclusión lavado corporal:
Los cuerpos de inclusión son partículas sólidas inactivas formadas por aglutinación intracelular de proteínas expresadas por bacterias, que generalmente existen en forma amorfa e insoluble. En el cuerpo de inclusión, la verdadera proteína objetivo solo representa aproximadamente el 50%, y el resto contiene lípidos, lipopolisacáridos, ácidos nucleicos y heteroproteínas, que están unidas al cuerpo de inclusión y afectan la renaturalización de la proteína del cuerpo de inclusión. Por tanto, el lavado antes de la desnaturalización es un paso muy necesario.
Además, el lavado de cuerpos de inclusión es útil para aumentar el rendimiento de replegamiento de proteínas recombinantes. Al eliminar las impurezas, se pueden reducir los obstáculos en el proceso de renaturalización, de modo que la proteína se pueda plegar y ensamblar correctamente de manera más eficiente, mejorando así la actividad y función de la proteína.
El lavado comúnmente utiliza menos del 1% del detergente neutro, como Tween, Triton, Urea y NP40 más EDTA y agentes reductores 2-mercaptotreitol (DTT), -mercaptoetanol repetido muchas veces, porque la capacidad de lavado del detergente se mejora con Para aumentar la fuerza iónica de la solución, en el lavado de los cuerpos de inclusión se puede agregar NaCl para aumentar la fuerza iónica.
Los cuerpos de inclusión se pueden usar para eliminar otros componentes de la solución de descomposición celular mediante centrifugación o filtración, las cuales aprovechan diferentes propiedades físicas de los cuerpos de inclusión.
Centrifugación:
Las proteínas de los cuerpos de inclusión son mucho más densas que el mismo volumen de fragmentos celulares, por lo que el cuerpo de inclusión se puede separar del resto de la célula mediante centrifugación. La centrifugación continua es la operación más utilizada para obtener cuerpos de inclusión en la producción industrial. Dado que la densidad de los fragmentos celulares es menor que la del cuerpo de inclusión, la velocidad de sedimentación es menor que la del cuerpo de inclusión. La suspensión y centrifugación continuas pueden centrifugar la mayor parte del cuerpo de inclusión, mientras que los fragmentos celulares se eliminan gradualmente.
Filtración (filtración de flujo tangencial): debido a los diferentes tamaños moleculares de los cuerpos de inclusión y las proteínas solubles, se puede utilizar el método de filtración, que puede reducir los costos operativos y facilitar la ampliación. La filtración de flujo tangencial (TFF) está impulsada por la diferencia de presión transmembrana. Las sustancias e impurezas más pequeñas que el tamaño de los poros de la membrana pasan a través de la membrana, mientras que las impurezas, como las células con partículas más grandes, quedan atrapadas. La apertura de la membrana generalmente utilizada para el lavado por filtración es 0.1 μm. La microfiltración de flujo tangencial de fibra hueca puede tratar directamente con un alto contenido sólido de material líquido, menos pasos, operación simple, la membrana se puede usar repetidamente mediante limpieza, lo que reduce la inversión en equipos y los costos operativos, de acuerdo con los requisitos de la producción automatizada modular.
El siguiente es un caso de aplicación para el lavado corporal de inclusión utilizando columnas de fibra hueca Guidling.
Usamos fibra hueca de 94 cm2 0.1-0.45 μm para concentrar 250 ml de líquido (peso molecular de la proteína objetivo 17 kd). Durante todo el proceso de lavado, se investigó la tasa de recuperación de la proteína objetivo y el agotamiento del flujo de membrana.
0-71min es el proceso de concentración, 71-224min es el proceso de lavado y filtración. Durante todo el proceso de microfiltración, la TMP aumentó gradualmente, la velocidad de entrada del líquido se mantuvo sin cambios y el flujo de material promedio fue de 12LMH.
Los resultados mostraron que la proteína objetivo quedó completamente atrapada y la tasa de recuperación de la proteína objetivo fue superior al 90%. Las columnas guía de fibra hueca son estables y adecuadas para esta aplicación.
Disolución del cuerpo de inclusión:
Los cuerpos de inclusión generalmente se disuelven bajo la condición de un agente desnaturalizante, urea o clorhidrato de guanidina, y las proteínas del cuerpo de inclusión disueltas se desnaturalizan por completo, es decir, excepto que se conservan la estructura primaria y los enlaces covalentes, se destruyen todos los enlaces de hidrógeno y los enlaces hidrofóbicos, y los hidrofóbicos. Las cadenas laterales quedan completamente expuestas.
La urea y el clorhidrato de guanidina son desnaturalizantes de potencia media, que se eliminan fácilmente mediante diálisis y ultrafiltración. La concentración general de urea 8-10M, clorhidrato de guanidina 6-8M. La disolución de urea tiene las ventajas de no ionización, neutralidad, bajo costo, la eliminación de proteínas después de la renaturalización no causará una gran cantidad de precipitación de proteínas y los cuerpos de inclusión disueltos se pueden purificar mediante una variedad de métodos cromatográficos, por lo que ha sido ampliamente utilizado. .
Replegamiento de proteínas del cuerpo de inclusión:
La proteína recombinante disuelta debe plegarse correctamente para formar una proteína funcional. Las técnicas de renaturalización incluyen la dilución de la solución de proteínas hasta casi neutral, la eliminación del desnaturalizante, la renaturalización en columna y la cromatografía de filtración en gel. Entre ellos, diluir la solución de proteína hasta casi neutral y eliminar el desnaturalizante es un método clásico común de renaturalización, especialmente el método de renaturalización por dilución tiene la tasa de utilización más alta.
Eliminación de desnaturalizantes:
Diálisis: la ventaja es que el volumen no aumenta y la tasa de eliminación del desnaturalizante se controla reduciendo gradualmente la concentración de líquido permeable externo, pero lleva mucho tiempo y es fácil formar agregados de proteínas inactivas, lo que no es adecuado para operación a gran escala y no se puede aplicar a la escala de producción.
Ultrafiltración (TFF): fácil de controlar la velocidad de diálisis, ya sea en investigación y desarrollo, prueba piloto o producción, puede eliminar desnaturalizantes (cambio de líquido + concentración) mediante ultrafiltración (TFF).
Purificación de proteínas del cuerpo de inclusión:
Los métodos de purificación de proteínas después de la renaturalización son similares a los de la purificación de proteínas solubles, a saber, cromatografía de intercambio iónico, cromatografía de filtración en gel, cromatografía de afinidad, precipitación con sal de sulfato de amonio, etc.
Los cuerpos de inclusión no tienen actividad biológica, no hay necesidad de preocuparse por la pérdida de actividad proteica y una gran cantidad de expresión no provocará la muerte celular y maximizará la resistencia al ataque de las proteasas. La fibra hueca de Jiuling se puede aplicar de manera flexible en el proceso de purificación posterior de cuerpos de inclusión. En el paso de lavado del cuerpo de inclusión, excelente rendimiento, en comparación con el lavado centrífugo, el uso de fibra hueca de microfiltración con tecnología de nueve edades para el lavado de filtración de flujo tangencial puede acortar en gran medida el tiempo del proceso y la tasa de recuperación general puede alcanzar más del 90%. La fibra hueca de Jiuling también se puede utilizar en el paso de renaturalización de proteínas de los cuerpos de inclusión. La turbidez del líquido de alimentación filtrado mediante fibra hueca de microfiltración se reducirá significativamente y la tasa de recuperación de proteínas es alta; El uso de fibra hueca de ultrafiltración no solo puede eliminar los desnaturalizantes, sino también acortar el tiempo de carga de la muestra cromatográfica, para ahorrar tiempo, reducir el volumen de relleno y reducir el costo de producción. La tasa de recuperación de la fibra hueca de microfiltración/ultrafiltración varía según los diferentes materiales y la tasa de recuperación general puede alcanzar el 90-95 %.
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Acerca de Guidling
Guidling Technology es una empresa nacional de alta tecnología que se centra en productos biofarmacéuticos, cultivo celular, purificación y concentración de biomedicina, diagnóstico y fluidos industriales. Hemos desarrollado con éxito dispositivos de filtrado centrífugo, casetes de ultrafiltración y microfiltración, filtros de virus, sistemas TFF, filtros de profundidad, fibras huecas, etc., que satisfacen plenamente los escenarios de aplicación de productos biofarmacéuticos, cultivos celulares, etc. Nuestras membranas y filtros de membrana se utilizan ampliamente en concentración, extracción y separación de prefiltración, microfiltración, ultrafiltración y nanofiltración. Nuestras numerosas líneas de productos, desde filtración de laboratorio pequeña y de un solo uso hasta sistemas de filtración de producción, pruebas de esterilidad, fermentación, cultivo celular y más, satisfacen las necesidades de prueba y producción. ¡Guidling Technology espera cooperar con usted!
