Purificación de bacteriófagos a escala industrial-: sección de 'clarificación' y 'ultrafiltración'
Los bacteriófagos, también conocidos como fagos, son virus que infectan bacterias. Un fago no puede sobrevivir por sí solo; debe parasitar a una bacteria huésped para reproducirse, lo que finalmente provoca que la bacteria se lisa. Debido a sus propiedades únicas, los fagos se pueden utilizar clínicamente para la identificación y tipificación bacteriana, así como para el tratamiento de ciertas infecciones bacterianas refractarias.
Este es un diagrama esquemático de la estructura de un bacteriófago (fuente de la imagen: Internet).
Se estima que las enfermedades de las plantas causan más del 30% de las pérdidas mundiales de rendimiento de los cultivos cada año. Entre los diversos patógenos, las enfermedades bacterianas son particularmente difíciles de controlar. Los métodos de control tradicionales se basan principalmente en antibióticos y agentes a base de cobre-. Sin embargo, el uso excesivo de antibióticos ha provocado una resistencia a los antimicrobianos cada vez más grave, mientras que el uso a largo plazo-de compuestos de cobre provoca una acumulación en el medio ambiente, lo que plantea riesgos para la salud de los seres humanos y los animales.
Debido a que los bacteriófagos tienen una alta especificidad, pueden matar selectivamente bacterias patógenas sin dañar los microbios beneficiosos u otras células huésped. Por lo tanto, los fagos pueden servir como alternativas a los antibióticos y a los agentes a base de cobre-. Mediante la terapia con fagos, los patógenos se pueden eliminar eficazmente y al mismo tiempo reducir el uso de antibióticos y compuestos de cobre.
Con continuos avances científicos y tecnológicos y una investigación más profunda sobre los bacteriófagos, las perspectivas de utilizar fagos para tratar superbacterias son cada vez más prometedoras. En el futuro, se espera que la terapia con fagos se convierta en una de las soluciones clave para la resistencia a los antibióticos. A través de la investigación y exploración en curso, la terapia con fagos puede surgir como una fuerza importante en el campo del tratamiento antimicrobiano, haciendo mayores contribuciones a la salud humana.
Sin embargo, para administrar bacteriófagos al cuerpo humano de forma segura y eficaz-especialmente mediante inyección intravenosa (IV)-queda un desafío importante:cómo obtener preparaciones de fagos ultra-puras.
El lisado de fagos es una mezcla compleja que, además de los fagos objetivo, contiene impurezas importantes como: bacterias huésped y sus fragmentos, ADN genómico y proteínas del huésped (impurezas relacionadas-con el huésped); endotoxinas como lipopolisacáridos (LPS) (impurezas relacionadas con procesos-); e impurezas relacionadas con el producto-, incluidas cápsides vacías y colas rotas.
Por lo tanto, el objetivo de la purificación no es solo lograr un alto título de fagos sino también reducir las impurezas-particularmente endotoxinas, ADN del huésped y proteínas-a niveles extremadamente bajos, según lo especificado por los estándares de la farmacopea.
Un proceso de purificación de fagos robusto y escalable generalmente sigue los principios comunes del procesamiento posterior y se puede dividir en los siguientes pasos lógicos:
Proceso de purificación posterior de bacteriófagos
Aclaración – Eliminación de Impurezas Macroscópicas
En la etapa inicial de la purificación de bacteriófagos, el objetivo principal del paso de clarificación es eliminar eficazmente las células bacterianas intactas y los restos celulares grandes del lisado crudo. El objetivo principal de este paso es proporcionar una alimentación limpia para columnas de cromatografía o unidades de separación de membrana posteriores, minimizando la carga de partículas sólidas. Esto previene eficazmente la obstrucción en las unidades de purificación posteriores, lo que garantiza un funcionamiento estable y una alta eficiencia del proceso durante todo el flujo de trabajo de purificación.
En los procesos tradicionales de bacteriófagos posteriores, la clarificación generalmente se basa en una centrifugación de baja-velocidad combinada con una filtración profunda de múltiples-etapas-que normalmente pasa secuencialmente a través de filtros de 0,8 μm, 0,45 μm y 0,22 μm-para eliminar eficazmente los restos de células huésped y las impurezas. Aunque maduro y confiable, este enfoque implica múltiples pasos, requiere mucho tiempo-y transferencias repetidas de material, lo que deja espacio para la optimización del rendimiento y la eficiencia generales.
Reemplazar la filtración profunda de múltiples-etapas con unacápsula de microfiltraciónpuede simplificar e intensificar significativamente el proceso. Específicamente, después de eliminar la mayoría de los restos celulares mediante centrifugación-a baja velocidad, el lisado se puede procesar directamente mediantefiltración de flujo tangencial (TFF)utilizando cápsulas de microfiltración con tamaños de poro definidos (0,45 μm o 0,22 μm). Esto permite la eliminación fina de impurezas de partículas y la permeación eficiente de los fagos objetivo en unun solo paso, integrando efectivamente las tradicionales tres etapas de filtración en una.
Esta innovación no solo reduce en gran medida el tiempo de operación y la manipulación manual, sino que también minimiza la pérdida de muestras y el riesgo de contaminación causado por múltiples pasos de filtración, mejorando así la recuperación general de los fagos. Mientras tanto, la operación de flujo tangencial mitiga la contaminación de la membrana, mejora el rendimiento y fortalece la solidez del proceso.
Por lo tanto, adoptar unaestrategia de clarificación integrada que combina cápsulas de microfiltración y centrifugación a baja-velocidadrepresenta un enfoque eficaz para mejorar la eficiencia y la rentabilidad-de la producción de bacteriófagos a gran-escala. Las cápsulas de microfiltración de Guidling Technology normalmente pueden reducir la turbidez del alimento a menos20 UNT, cumpliendo plenamente con los requisitos de los pasos posteriores de ultrafiltración y cromatografía.
Captura y Concentración – Purificación Primaria y Reducción de Volumen
durante elcaptura y concentracionEn la etapa de purificación de bacteriófagos, el objetivo principal es recuperar eficientemente los fagos de grandes volúmenes de lisado clarificado y al mismo tiempo lograr la concentración del producto primario y el intercambio de tampón. Este paso depende principalmente deFiltración de flujo tangencial (TFF)tecnología.
El principio de TFF radica en el uso de membranas de ultrafiltración con límites de peso molecular específicos-(normalmente 100 o 300 kDa). Pequeñas impurezas moleculares, como componentes residuales de los medios de cultivo, metabolitos y pequeñas proteínas, pasan selectivamente a través de los poros de la membrana, mientras que los fagos se retienen en el retenido debido aefectos de exclusión de tamaño, permitiendo su efectiva separación y enriquecimiento.
Dentro de un sistema TFF,modo de ultrafiltraciónse emplea para lograr la concentración de volumen, mientras se cambia amodo de diafiltraciónpermite el intercambio de tampones, creando así condiciones fisicoquímicas adecuadas para pasos posteriores como el tratamiento enzimático.
Esta tecnología ofrece las ventajas combinadas dealta eficiencia de procesamientoyexcelente escalabilidad, lo que lo hace ideal para producción a gran-escala. Según GuidlingTechnology, las cápsulas de ultrafiltración normalmente logran unatasa de recuperación de fagos del 90 al 95%, dependiendo del material específico que se esté procesando.
Purificación profunda: eliminación específica de impurezas críticas
En la purificación de bacteriófagos,purificación profundaes el paso clave que determina la calidad del producto final. Su objetivo principal es eleliminación específica de impurezas críticas, como las endotoxinas. TradicionalCentrifugación en gradiente de densidad de CsCl-debido a su toxicidad y falta de escalabilidad-se ha eliminado de los procesos industriales. Los enfoques actuales se centran entecnologías basadas en cromatografía-, con una integración innovadora depretratamiento enzimático.
Una estrategia avanzada que combinacromatografía de intercambio aniónico (AEC)conpretratamiento con fosfatasa alcalina (AP)ha sido desarrollado. Tanto los fagos como los lipopolisacáridos (LPS) llevan cargas negativas, lo que genera competencia por los sitios de unión en los procesos AEC convencionales y provoca una co-elución que reduce la eficiencia de la purificación. Al introducir un pretratamiento con AP antes de la carga de AEC, la enzima elimina específicamente los grupos fosfato del lípido A y las regiones centrales de polisacárido de las moléculas de LPS, reduciendo significativamente su carga negativa neta. Esto efectivamente debilita su afinidad por el medio de intercambio aniónico.
Los datos experimentales muestran que tratar la muestra con20 U/mL APseguido de purificación usandoAdsorbentes de membrana de ligando de amina cuaternaria (Q) o columnas monolíticaspuede lograr hasta98,8% de eliminación de endotoxinas, manteniendo excelentes tasas de recuperación de fagos. Este enfoque resuelve con éxito el problema de larga data de la co-adsorción de endotoxinas durante la purificación de fagos.
Pulido – Refinamiento Final y Formulación
en la finaletapa de pulidoEn la purificación de bacteriófagos, el objetivo principal es lograr la máxima pureza y preparación para la formulación. Esto incluye eliminar trazas de impurezas residuales, eliminar los aditivos introducidos durante el proceso (como la fosfatasa alcalina) e intercambiar completamente el producto por un sistema tampón compatible con la formulación-.
Esto normalmente se logra a través dediafiltración secundaria, un método probado y eficiente que permite tanto la eliminación profunda de contaminantes de moléculas pequeñas- como un intercambio exhaustivo de tampones.
Para mejorar aún más la pureza del producto,cromatografía de interacción de enlaces de hidrógeno-ocromatografía en modo mixto-(MMC)se puede presentar como unpaso de pulido final. Estas técnicas utilizan mecanismos de separación multidimensional para eliminar trazas de componentes con propiedades fisicoquímicas similares a las del fago objetivo. El resultado es un ingrediente farmacéutico activo (API) de bacteriófago altamente purificado que cumple con los estrictos estándares de calidad requeridos paraformulaciones de grado-inyectable.
Al seleccionar una combinación de módulos de membrana de microfiltración y ultrafiltración con un área de membrana de 1 m², el volumen máximo estimado de bacteriófago que se puede procesar alcanza hasta 100 L. El flujo del material de microfiltración es de aproximadamente 20 a 50 LMH, y el flujo del material de ultrafiltración es de aproximadamente 15 a 30 LMH. En comparación con los métodos de procesamiento tradicionales, este enfoque puede cumplir de manera eficiente los requisitos del proceso tanto de clarificación como de ultrafiltración.
Referencias:
Saavedra et al.,Purificación escalable de preparaciones de bacteriófagos. (2025)
Lapras et al.,Racionalización del proceso de purificación de un ingrediente farmacéutico activo en fagos. (2024)