Compartir literatura|¿Di adiós a la purificación compleja? Un nuevo método de tensioactivo TFF + mejora la eficiencia y reduce los costos en la producción de vectores de AAV
La terapia génica se está desarrollando rápidamente, pero su alto costo sigue siendo una barrera importante que evita el acceso más amplio al paciente. Entre los impulsores clave de este costo se encuentra el complejo proceso de producción de los vectores de virus asociados (AAV) adeno -. Un estudio publicado en biotecnología y bioingeniería ha desarrollado un nuevo método de purificación que combina filtración de flujo tangencial (TFF) con tensioactivos, que promete simplificar el proceso de purificación AAV y reducir los costos. Involucremos en esta investigación dirigida por un equipo de la Universidad de Tokio.
1. Antecedentes de investigación: desafíos y estado actual de la purificación de AAV
Los vectores AAV se han convertido en herramientas de administración de "estrella" en la terapia génica debido a su alta seguridad, baja inmunogenicidad, capacidad de infectar tanto las células divisorias y no - y la capacidad de la expresión del gen del término largo -}. Sin embargo, su proceso de producción es complejo, particularmente los pasos de purificación aguas abajo, que generalmente involucran múltiples rondas de centrifugación y cromatografía. Estos métodos son tiempo - consumidor, mano de obra - intensivo, difícil de escalar y costoso.
A escala de laboratorio, la purificación a menudo se basa en el cloruro de cesio o la ultracentrifugación de gradiente de densidad de yodixanol, que es difícil de escalar para la producción industrial. La cromatografía de afinidad se usa cada vez más, pero las bajas condiciones de elución de pH que requiere pueden afectar la infectividad viral. Por lo tanto, desarrollar un método de purificación AAV simple, eficiente, suave y escalable es fundamental.
La filtración de flujo tangencial (TFF) es una técnica de separación basada en el tamaño - comúnmente utilizado para concentrar y amortiguar - intercambiar bioproductos. Sin embargo, el TFF convencional tiene una capacidad limitada para eliminar impurezas como las proteínas de las células huésped (HCP) y el ADN durante la purificación de AAV, a menudo dejando los agregados de proteínas.
2. Enfoque innovador: TFF combinado con tensioactivos para purificación eficiente
Para superar las limitaciones de TFF tradicional, los investigadores Rimi Miyaoka, Yuji Tsunekawa y sus colegas de la Universidad de Tokio idearon una estrategia inteligente: el uso de tensioactivos para inhibir la agregación y la interacción de las proteínas de impureza, lo que les permite pasar a través de la membrana de ultrafiltración de TFF (500 KDA Molecular). nm en tamaño).
Probaron tres tipos de tensioactivos:
- Non - Ionic:Glucósido de octilo
- Aniónico:Desoxicolato de sodio
- Zwitteriónico:Chapas
El estudio encontró que usar un tensioactivo iónico no - solo era ineficaz. Tanto el desoxicolato de sodio aniónico como el CHAP zwitteriónico mejoraron significativamente la eliminación de proteínas residuales, y se dirigieron a diferentes poblaciones de proteínas. En última instancia, la combinación de desoxicolato de sodio al 0,5% con un 1% de CHAP produjo resultados notables, eliminando casi por completo las proteínas residuales del huésped. El análisis de la página SDS - mostró solo las tres bandas de proteínas Clear AAV Capsid (VP1/VP2/VP3).
Figura 1. Proceso de purificación de TFF sin tensioactivos;(a) SDS - Page gel electroforesis; (b) Microscopía electrónica de transmisión (TEM)
Figura 1. Proceso de purificación de TFF con tensioactivos;(a) SDS - electroforesis en gel de página; (b) Microscopía electrónica de transmisión (TEM)
3. Resultados de la investigación: alta pureza, actividad y seguridad
- Extracción de impurezas eficientes:El nuevo método alcanzó el 99.98% de eliminación de HCP y el 95% de eliminación de ADN, con pureza comparable o excediendo la de la cromatografía de afinidad.
- Infectividad mejorada:Los experimentos in vitro mostraron que los vectores AAV1 purificaron usando este método infectaron las células HEK293 de manera más eficiente que las purificadas por la cromatografía de afinidad (24.9% frente a 20.8%), lo que indica una mejor preservación de la bioactividad viral.
- Buena seguridad in vivo:Después de la inyección local de vectores AAV1 purificados en el músculo esquelético del ratón, no se observó una inflamación o daño tisular significativo después de dos semanas, lo que demuestra que la seguridad in vivo sea buena.
- Aplicabilidad de serotipo amplio:El método purificó con éxito múltiples serotipos - que incluyen AAV1, AAV5, AAV8 y AAV9-FROM CELUCT SUPERNATANTS. Sin embargo, para AAV2, que existe principalmente en lisados celulares con alta carga de impureza, se necesita una optimización adicional.
4. Resumen y perspectiva
Este estudio desarrolló un nuevo proceso de purificación AAV simple, rápido (1.5 horas), eficiente y escalable. Al combinar el desoxicolato y los CHAP, abordó con éxito el desafío de la agregación de proteínas residuales durante la purificación de TFF.
Las ventajas del método incluyen:
- Evitar las duras condiciones de pH bajo, preservar mejor la actividad viral
- Reducir los pasos de cromatografía, simplificar el flujo de trabajo y ahorrar tiempo y costos
- Fácilmente escalable, adecuado para la producción industrial de escala grande -
- Proporcionar una nueva estrategia para purificar otras biomacromoléculas como exosomas, otros virus y anticuerpos recombinantes
Las limitaciones actuales incluyen recuperación viral subóptima e incapacidad para separar las cápsides vacías de las partículas virales completas, lo que sugiere que su mejor uso puede ser como una primera captura de paso - en un flujo de trabajo de purificación de pasos múltiple -}.
En conclusión, esta investigación ofrece una nueva opción atractiva para la producción de vectores AAV aguas abajo y tiene el potencial de reducir significativamente el costo de los medicamentos de terapia génica, facilitando su aplicación más amplia.