Resumen:

Este artículo revisa dos factores clave que deben considerarse en las estrategias de purificación de proteínas: requisitos de aplicación aguas abajo y las características biológicas de las proteínas mismas. El artículo enfatiza que la purificación de proteínas de alta calidad es la base de la confiabilidad y repetibilidad de los datos experimentales, especialmente para la producción de proteínas recombinantes. Diferentes escenarios de aplicación tienen requisitos específicos para la pureza de las proteínas, la actividad o el contenido de endotoxinas, y las características de proteínas pueden afectar significativamente las estrategias de purificación. Según casos específicos, el artículo ilustra que las proteínas únicas deben adoptar esquemas de purificación personalizados. Finalmente, se propuso un proceso de producción sistemática de proteínas (Figura 1), enfatizando el control de calidad de procesamiento completo de la selección de sistemas de expresión, diseño de construcción a la optimización de purificación y recomendando la evaluación de la homogeneidad de proteínas y la funcionalidad a través de técnicas biofísicas (como SEC-Mals, DSF, etc.). Este artículo tiene como objetivo proporcionar orientación práctica para los investigadores, ayudándoles a formular estrategias de purificación eficientes y repetibles basadas en las características y los requisitos de aplicación de las proteínas objetivo, mejorando así la calidad y eficiencia de la investigación científica.

 

Figura 1. Diagrama esquemático del proceso de producción de proteínas

 

Producción de proteínas de alta demanda: ejemplos de identificación de problemas, diseño de estrategia de mitigación y producción correspondiente

 

1. El ácido nucleico se une a la proteína:

Al purificar proteínas de unión al ácido nucleico, se requieren múltiples pasos para eliminar la contaminación del ácido nucleico. Durante la lisis, se deben agregar nucleasas (como la nucleasa SM (Benzonase®) o DNasa o RNasa), pero los ácidos nucleicos unidos no se pueden eliminar por completo. Reemplace los pasos de eliminación de ácido nucleico, como PEI o precipitación de sulfato de estreptomicina, purificación de heparina o cromatografía de intercambio iónico. La presencia de ácidos nucleicos se controló por la relación de A26 0 nm\/a28 0 nm a lo largo del proceso de purificación. Si la relación fue inferior a 0.6, indicó que la pureza de la proteína era relativamente alta y la contaminación del ácido nucleico era mínimo. Para las proteínas con ácidos nucleicos fuertemente unidos, se pueden desnaturalizar temporalmente (como tratados con urea) y luego renaturar. Puntos clave: use reactivos de alta calidad, amortiguadores frescos y columnas limpias (limpie con NaOH de 0,5 m antes de usar).

 

2. Ratón Ferritina Cadena pesada:

El propósito de producir la proteína de la cadena pesada de ferritina de ratón purificada (MFTH1) es la microscopía crioelectrónica de una sola partícula de alta resolución (CRYO-EM). El vector de expresión de Escherichia coli codificado MFTH1 sin etiquetar fue interrumpido ultrasónicamente sin agregar ninguna nucleasa. Después de calentar a 7 0 grado, se sometió a precipitación de sulfato de amonio, diálisis y pasos de cromatografía de exclusión de tamaño. La muestra resultante mostró la presencia de una gran cantidad de contaminantes en las imágenes de microscopía crioelectrónica (Figura 2A), que era completamente inadecuada para su aplicación. Optimizar los pasos. Agregue la nucleasa SM durante el proceso de lisis celular y el proceso de diálisis después de la precipitación de sulfato de amonio, y luego agregue el paso de cromatografía de intercambio de aniones para reducir la relación de A26 0 NM\/A280NM de 1.4 a 0.8. Después de la cromatografía de exclusión de tamaño, la relación de A260NM\/A280NM de la muestra final de MFTH1 fue de 0.56. Las imágenes de microscopía SDS-PAGE y crioelectrónico (Figura 2B) mostraron que la proteína era muy pura, lo que indica que los contaminantes se habían eliminado de manera efectiva.

Figura 2 cadena pesada de ferritina de ratón

 

 

 

3. Proteína quimérica DSRBEC (DSRBD-EGF- Chimera):

DSRBEC se forma mediante la fusión del dominio de unión a ARN de doble cadena (DSRBD) de la proteína quinasa R humana y el factor de crecimiento epidérmico humano (HEGF). Cuando DSRBD se expresa en Escherichia coli, muestra una capacidad de unión de dsRNA extremadamente alta. Después de la lisis celular, el ARN contaminente obstaculizará la unión de proteínas recombinantes a la columna de cromatografía de afinidad de iones metálicos fijos (IMAC). Los métodos convencionales como PEI o precipitación de sulfato de estreptomicina, tratamiento con RNasa o soluciones de tampón de alta sal no pueden eliminar el ARN. La lisis celular se realizó usando un tampón que contenía urea 4M. El sobrenadante se cargó en una columna iMac, y 4m a 0 M urea se usó lentamente durante la noche (renaturación de columna). El búfer de renaturación se agregó con imidazol y se eluyó de la columna IMAC. El refinamiento final se llevó a cabo a través de la filtración de gel Superdex 75 para obtener DSRBEC funcionalmente activo.

 

4. Proteínas unidas a cationes divalentes u otros cofactores:

Para las proteínas que interactúan con cationes divalentes como Zn 2+, Fe 2+, Cu 2+ u otros cofactores, es crucial agregar cationes divalentes específicos (u otros cofactores) durante la expresión. También se requiere una pequeña cantidad de los mismos cationes divalentes (u otros cofactores) durante el proceso de purificación. Sin embargo, se debe evitar el uso de cualquier agente quelante (como EDTA, EGTA) y agentes reductores de quelantes (como DTT o DTE). Al tratar con proteínas unidas a cationes divalentes, se debe usar una mezcla de inhibidores de la proteasa sin agentes quelantes para confirmar la presencia real de cationes divalentes (u otros cofactores) en la proteína purificada a través de métodos espectroscópicos (como espectrofotometría de absorción atómica).

 

5. Ferridoxina recombinante (RFD) que contiene un grupo [2FE ± 2S] de cianobacterias termofílicas mastigocladus laminosus

La ferridoxina es una proteína soluble de hierro-azufre que participa en las reacciones de transferencia de electrones. La ferrordoxina de tipo planta transporta un solo grupo [2FE ± 2S] como aceptador de electrones del fotosistema I. La cepa Escherichia coli BL21 (DE3) expresó la proteína RFD recombinante en el medio TB que contiene FECL3 de 10 mm y antibióticos. La elución de la columna de captura iMAC se realizó utilizando un tampón que contiene histidina de 10 mm para evitar imidazol y evitar la destrucción del clúster [2Fe ± 2S]. El intercambio de aniones y la cromatografía de exclusión de tamaño se usaron para una purificación y concentración adicionales a 12 mg\/ml para el cribado de cristalización. En comparación con la producción recombinante de ferrordoxina, la ferrordoxina natural purificada de las algas azul verde mastigocladus laminosus logró una mayor resolución durante la cristalización.

 

6. Proteínas utilizadas como antígenos

Las proteínas a menudo se usan como antígenos para recuperar ligandos específicos del objetivo. Lo primero que debe considerar es si la proteína se usa para la inmunidad in vivo para obtener IgG monoclonal o policlonal convencional, o para programas que involucran IgG de camello o procesos de selección in vitro.

 

6.1 Antígenos utilizados para la producción de anticuerpos de rutina

Cuando los antígenos se usan para producir anticuerpos IgG monoclonales, el plegamiento correcto del antígeno generalmente no es necesario, porque la mayoría de los anticuerpos monoclonales reconocen epítopos lineales que no se ven muy afectados por la estructura del antígeno, e incluso los antígenos desnaturalizados (como las proteínas del cuerpo de inclusión) siguen siendo efectivos. Sin embargo, la pureza debe controlarse estrictamente para evitar contaminantes inmunogénicos fuertes que interfieran con la respuesta inmune y causan el dominio de los anticuerpos no objetivo.

 

6.2 Detección de la biblioteca conjugada

Se debe prestar especial atención a mantener la conformación natural del antígeno durante el procesamiento de la biblioteca de nanobodios obtenidos por inmunización de camello. A diferencia de los anticuerpos convencionales, los anticuerpos camel (especialmente los nanobodos) tienden a reconocer los epítopos estructurales, que está relacionado con su estructura de sitio complementaria convexa única. Del mismo modo, al detectar grandes bibliotecas de anticuerpos sintéticos o naturales in vitro, el antígeno debe mantener una estructura que sea completamente consistente con la aplicación objetivo. Dado que el proceso de detección en sí no es sesgado, si el antígeno tiene mal pliegue, agregación o heterogeneidad conformacional, se puede seleccionar una gran cantidad de conjugados dirigidos a epítopos no naturales.

 

 

 

7. Proteínas que contienen enlaces disulfuro intermoleculares o intramoleculares o cisteína libre

Los enlaces disulfuro son cruciales para estabilizar la estructura natural de las proteínas. Durante el proceso de purificación, al purificar proteínas que contienen enlaces disulfuro intermoleculares o intramoleculares, es necesario evitar agregar agentes reductores para evitar cambios conformacionales de las proteínas, alterando así sus funciones. Para las proteínas que contienen cisteína libre, los agentes reductores son indispensables en todos los pasos del proceso de purificación, especialmente durante el almacenamiento, para evitar la formación de enlaces disulfuro artificiales. Los agentes reductores más utilizados son ditiotreitol (DTT), -mercaptoetanol (-me) y tris (2- carboxietil) clorhidrato de fosfina (TCEP). Para las resinas iMAC que son incompatibles con DTT o TCEP, se recomienda usar -me y reemplazarlas con otros agentes reductores en pasos posteriores.

 

8. Fragmento de anticuerpos recombinantes

Aunque la estructura de los fragmentos de anticuerpos recombinantes (como los nanobodos) es más simple que la de IgG, su función depende de la formación correcta de enlaces disulfuro. En los sistemas de expresión bacteriana, incluso con la adopción de estrategias de optimización, aún pueden ocurrir productos mal plegados o parcialmente plegados, que existen tanto en la parte soluble como en el cuerpo de inclusión. Más oculto es que incluso los fragmentos de anticuerpos plegados correctamente pueden formar agregados solubles (agregación coloide) a través de placas hidrófobas en la superficie. Dichos agregados son difíciles de identificar en las pruebas funcionales de rutina (como ELISA) porque la unión multivalente puede enmascarar la disminución de la afinidad del monómero, pero su presencia puede afectar seriamente las aplicaciones que dependen del tamaño de la molécula pequeña (como la microscopía de súper resolución). Por lo tanto, confiar únicamente en SDS-PAGE es insuficiente para evaluar la calidad de la muestra. Se deben adoptar métodos biofísicos como la filtración en gel (Figura 3) para distinguir los monómeros (picos principales) de los agregados (picos de volumen de exclusión). Los puntos de control clave incluyen: optimizar el entorno redox durante la expresión para promover la formación de enlaces disulfuro y optimizar las condiciones de almacenamiento después de la purificación para evitar la agregación. Estas medidas son cruciales para garantizar la monodispersidad y la función de los fragmentos de anticuerpos.

Figura 3. Separación de filtración en gel de agregados solubles de nanobodios

 

9. Fragmentos solubles de receptor de linfocitos LLT1

La expresión recombinante de proteínas dependientes del enlace disulfuro (como el receptor de linfocitos LLT1) a menudo enfrenta dificultades de plegado. La filtración en gel de LLT1 de tipo salvaje mostró picos de agregación y picos de dímero (Figura 4A), pero la espectrometría de masas reveló el plegamiento incorrecto causado por la cisteína no apareada en el dímero (Figura 4B). Para este propósito, se diseñaron dos mutantes: uno eliminó el problema cisteína, lo que resultó en una caída repentina en el rendimiento (Figura 4A); Después de la introducción de la neocisteína para reconstruir el enlace disulfuro conforme, el mutante no solo tenía un alto rendimiento y una buena estabilidad, sino que también podía cristalizar (Figura 4C), y la estructura 3D confirmó que el mutante formaba el enlace disulfuro correcto y mantenía el plegamiento natural. Este caso demuestra que al diseñar racionalmente enlaces disulfuro conformes, combinados con filtración en gel y análisis de espectrometría de masas, el problema de plegamiento de las proteínas recombinantes se puede resolver de manera efectiva, y se puede obtener proteínas funcionales con estructuras estables y altos rendimientos.

Figura 4. La reconstrucción del enlace disulfuro mejora el plegamiento y el rendimiento de LLT1 soluble

 

 

 

10. Proteínas fácilmente agregables

La purificación de las proteínas recombinantes a menudo enfrenta el problema de la agregación, y su formación sigue el mecanismo de "crecimiento de la nucleación": una pequeña cantidad de agregados solubles se forman primero y luego desencadena la agregación insoluble a gran escala. Para abordar este desafío, se deben adoptar estrategias de niveles múltiples: en la etapa de expresión, esto se puede lograr optimizando la tensión, reduciendo la temperatura de cultivo, utilizando medios de cultivo modificados o diferentes proteínas de fusión solubilizantes, y reemplazar los sistemas de expresión (insectos\/células mammalianas), etc. Durante la purificación de purificación, la operación rápida (en un entorno de 4 grados C) se requiere evitar la proteína de la ima, y ​​una "concentración de la patificación rápida" (como se requiere una concentración rápida de la configuración rápida "(como se requiere una conexión rápida (como se requiere un entorno de la generación rápida" (como se requiere un entorno de la generación rápida (como ". a Sec) debe adoptarse para eliminar rápidamente los núcleos agregados. En términos generales, cuando las soluciones de tampón de detección, se deben tener en cuenta factores como la composición de los componentes, el valor de pH, el agente disociador o el solubilizante (Figura 5). A través de la optimización fina de la detección ortogonal (como Sec, CD, LS, DSF y cambio de temperatura basado en el calor de fluorescencia, etc.), se determinaron la calidad de proteína y la solución tampón más adecuada.

Figura 5. Estrategias para aliviar la agregación de proteínas

 

11. Cristalización de la quinasa CLK1 humana (cómo obtener lotes reproducibles)

Para obtener la quinasa CLK1 no fosforilada homogénea para los estudios de cristalización, se adoptó un esquema de colaboración multi-estrategia. En primer lugar, se coexpresó con λ -fosfatasa en Escherichia coli para eliminar la heterogeneidad de la autofosforilación. Aunque se redujo el rendimiento, se aseguró la desfosforilación completa. Después de la captura de iMac, el eluyente se complementó con estabilizadores (arginina de 50 mm, ácido glutámico de 50 mm y DTT de 10 mm) para evitar la agregación, concentrado, y la etiqueta se eliminó por digestión TEV. Luego, el oligómero correcto fue separado por Sec (que contenía 5% de glicerol y -me). El paso de intercambio de aniones cruciales finales distingue entre los grupos CLK1 cristalino (no fosforilado) y no cristalino (parcialmente fosforilado). Vale la pena señalar que el modo de lisis celular afecta significativamente la estabilidad de la proteína: el método de alta presión y alta temperatura conduce a una agregación irreversible de CLK1, destacando la importancia del tratamiento leve para la preparación de la quinasa.

 

 

 

12. Producir galectina -1 con capacidad de unión a ligando estable

Para preparar la galectina funcional -1 para los estudios de unión de ligando, las estrategias de expresión y purificación de cuatro construcciones (galectina de tipo salvaje no etiquetada y marcada con His marcada -1, se compararon la galectina de mutante sin cisteína sin cisteína sin cisteina. Los hallazgos clave indican que la purificación de la cromatografía de afinidad de lactosa puede detectar efectivamente proteínas plegadas correctamente, pero debe combinarse con diálisis exhaustiva (tampón HEPES) para eliminar completamente la lactosa del sitio de unión y restaurar la actividad de CRD. La galectina de tipo salvaje -1 es propensa a la oxidación e inactivación, y su estabilidad sigue siendo limitada incluso en presencia de agentes reductores (Figura 6). Sin embargo, el mutante libre de cisteína mejora significativamente la estabilidad a largo plazo al tiempo que mantiene la actividad de aglutinación comparable y la estabilidad térmica (verificada por NANODSF, ITC, etc.) al eliminar la dependencia del enlace disulfuro.

Figura 6. La caracterización hidrodinámica de la galectina recombinante -1 revela su inestabilidad

 

13. Retirada de endotoxinas

El método de eliminación de endotoxinas se basa en la cromatografía de afinidad que incluye cromatografía cargada positivamente (intercambio de aniones), el uso de ligandos policacionales (como poli-l-lisina (PLL), poliamina inmovilizada (polimixina B)) y la adición del titon titon X {}}}}}}}. Durante el proceso de purificación, preste atención a la preparación de la solución de amortiguación con agua libre de LPS y use nuevas columnas o columnas que solo se han utilizado en otras purificaciones sin LPS. Para la contaminación de endotoxinas, la bomba cromatográfica\/sistema de fluido se puede incubar durante la noche en 0. 5m NaOH o durante 4 horas en 1. 0 M NaOH. La cantidad final de LPS en la muestra se evaluó utilizando el reactivo de lisado de amebocitos Limulus (LAL), y se verificó si estaba por debajo del límite requerido para la aplicación específica.

 

14. Complejo de proteínas

La expresión y purificación de los complejos de proteínas debe optimizarse de acuerdo con condiciones específicas. Los desafíos incluyen la inestabilidad o el plegamiento incorrecto de las subunidades. Cada subunidad se puede expresar de forma independiente y ensamblar in vitro, o coexpresar para formar complejos de proteínas funcionales. El diseño de la construcción debe introducirse cuidadosamente con etiquetas de purificación o detección para evitar interferir con el ensamblaje, especialmente cuando la información compleja es limitada y se requieren optimizaciones múltiples. Durante el proceso de purificación, la integridad y la estabilidad del complejo deben evaluarse. Los métodos incluyen SDS-PAGE (detección de subunidades), SEC (homogeneidad), Sec-Mals (análisis de masa molar), fotometría de masa o espectrometría de masas naturales (verificación de masa). Cabe señalar que el complejo puede disociarse a bajas concentraciones. En este momento, el método o tampón cromatográfico (como a través de la deriva térmica o las condiciones de detección de DSF) debe optimizarse. Además, reducir los pasos de purificación puede evitar la pérdida de subunidades de interacción débiles y equilibrar la eficiencia de purificación y la integridad del complejo.

 

 

 

15. Purificación de complejos de antígeno-anticuerpos

Los complejos de anticuerpos-antígeno son ejemplos típicos de complejos de proteínas. Su cocristalización puede revelar patrones de unión y guiar la optimización de la ingeniería de anticuerpos. Los métodos tradicionales requieren purificación separada de antígenos y anticuerpos y luego mezclarlos. Sin embargo, estudios recientes han demostrado que las estrategias de coexpresión y co-purificación son más eficientes. Solo se necesita una sola purificación para obtener el complejo, y al mismo tiempo, los antígenos inestables se pueden estabilizar a través de anticuerpos, e incluso se puede lograr la expresión libre de etiquetas. En esta situación específica, la filtración SDS-PAGE y el gel (SEC) suelen ser suficientes para evaluar la pureza y la calidad del complejo.

 

Resumen

La purificación de proteínas es una tecnología fundamental en la investigación científica. La producción de proteínas a escala académica generalmente sigue las estrategias estándar y puede producir proteínas solubles de alto pureza de nivel miligramo, que se usan ampliamente en biología estructural, bioquímica e investigación funcional. Sin embargo, los requisitos especiales de las aplicaciones aguas abajo (como la necesidad de no endotoxina en experimentos con animales y la contaminación de la nucleasa en la investigación del ácido nucleico) o las características inherentes de las proteínas (como la fácil agregación, que contienen enlaces disulfuro o afinidad de ácido nucleico alta) a menudo requieren soluciones personalizadas. Esta revisión, en respuesta a estas circunstancias especiales, propone estrategias refinadas que van desde la selección de sistemas de expresión, el diseño de construcciones (optimización de etiquetas y límites de dominio) hasta el proceso de purificación e introduce un control de calidad (como SEC, SDS-PAGE, Detección de Actividad, etc.) en los pasos clave. Algunas aplicaciones también requieren análisis adicional (como la detección de endotoxinas y la determinación de residuos de ácido nucleico), similar al concepto de "garantía de calidad" (QA) en la industria biofarmacéutica, es decir, para prevenir defectos a través de procesos sistemáticos. Al formular las pautas de control de calidad y aclarar los estándares específicos para los reactivos de proteínas utilizados en la investigación científica, el objetivo es establecer normas de purificación de proteínas más rigurosas para los laboratorios académicos, mejorar la confiabilidad y la repetibilidad de los datos experimentales, y cerrar la brecha entre la investigación básica y los estándares industriales.

 

Doi: 10.1186\/s 12934-022-01778-5