Tecnología de membranas y clarificación de vacunas (Ⅰ)
Las vacunas provienen de una variedad de fuentes, incluidos extractos de tejidos, células bacterianas, partículas virales, proteínas y ácidos nucleicos producidos por células recombinantes de mamíferos, levaduras y células de insectos.
El método más común de producción de vacunas se basa en un proceso de fermentación inicial seguido de una purificación. La producción de vacunas es un proceso complejo que implica muchos pasos y procesos diferentes. Elegir el método de purificación adecuado es fundamental para lograr la pureza deseada del producto final. La clarificación de las vacunas es un paso importante que tiene un impacto significativo en la recuperación del producto y la purificación posterior. Se pueden utilizar varias técnicas para clarificar las vacunas. La elección del método y el equipo de recolección depende del tipo de batería, la naturaleza del producto que se recolecta y el líquido del proceso. Estas técnicas incluyen la filtración por membrana (microfiltración, filtración de flujo tangencial), la centrifugación y la filtración profunda (filtración de flujo normal). Según una larga experiencia, la clarificación de la cosecha de vacunas generalmente se logra mediante centrifugación seguida de una filtración profunda.
En los últimos años, las técnicas basadas en membranas han ganado protagonismo en la clarificación de vacunas. Los procesos previos utilizan cada vez más tecnologías desechables, por lo que las estrategias de recolección deben cambiar. Este artículo ofrece una descripción general completa de las diferentes tecnologías basadas en membranas y sus aplicaciones en la clarificación de vacunas.
01 Introducción
Las vacunas son un componente fundamental de nuestra prevención de enfermedades infecciosas, que siguen siendo una causa alarmante de muerte. Entre 2 y 3 millones de personas se salvan de la difteria, el tétanos, la tos ferina y el sarampión cada año gracias a la inmunización. Las vacunas cubren una amplia gama, desde pequeñas proteínas recombinantes hasta partículas virales completas y bacterias enteras. Pueden producirse mediante diferentes sistemas: huevos, células de mamíferos, bacterias, etc. Debido a la complejidad y diversidad de las vacunas, actualmente no existe un protocolo o plantilla de purificación convencional, a pesar del creciente interés en las plataformas de vacunas.
Por lo general, un proceso de elaboración de vacunas se puede dividir en tres partes: la fase inicial (producción y clarificación), el tratamiento posterior (purificación que incluye ultrafiltración, cromatografía y tratamiento químico) y la formulación (operaciones de llenado final). Independientemente del sistema de producción, la clarificación (la eliminación inicial de sustancias no deseadas) desempeña un papel clave para determinar un proceso de purificación sólido. Un paso de clarificación adecuado elimina principalmente células enteras, restos celulares, coloides y agregados grandes para reducir la carga del procesamiento posterior. En algunos casos, la clarificación también puede reducir las impurezas insolubles, las proteínas de la célula huésped (HCP) y los ácidos nucleicos de la célula huésped. Como cualquier otro paso de purificación, el paso de clarificación debe optimizarse para lograr el máximo rendimiento y pureza del producto, al tiempo que se adapta a la especificidad y las limitaciones de producción de la vacuna.
Debido a la heterogeneidad de los tipos de vacunas, se utilizan diversas técnicas para su clarificación, incluida la centrifugación o la filtración (Tabla 1).
Por lo general, se requieren varias series de operaciones para lograr la clarificación deseada. La primera operación está diseñada para eliminar partículas más grandes (clarificación primaria) y la segunda operación está diseñada para eliminar coloides y otras partículas submicrónicas (clarificación secundaria). La centrifugación a baja velocidad sirve como una opción de clarificación única, que permite eliminar células y restos celulares mediante precipitación. La centrifugación puede manejar altas cargas de sólidos y se ha utilizado ampliamente en modo continuo o por lotes y en centrífugas de disco. Requiere una alta inversión de capital y costos de mantenimiento, y enfrenta desafíos en la ampliación debido a la falta de un modelo confiable de reducción de escala. Sin embargo, algunos fabricantes de vacunas comerciales utilizan centrífugas en la producción a gran escala que implica grandes volúmenes de procesamiento y más actividades de producción.
La filtración de clarificación se puede realizar mediante filtración de flujo normal (NFF, también conocida como filtración de extremo muerto) o filtración de flujo tangencial (TFF, también conocida como filtración de flujo cruzado). También existen modos de filtrado específicos (filtros profundos) que contienen materiales con carga positiva y auxiliares de filtrado que mejoran la retención de restos celulares, coloides y componentes no deseados con carga negativa.
Los filtros de membrana retienen partículas por exclusión de tamaño y no tienen una gran capacidad de retención de suciedad, por lo que son adecuados para los pasos de clarificación secundaria. Tanto los filtros profundos como los filtros de membrana son fáciles de escalar e implementar (diseño de sistema simple). A diferencia de los filtros NFF, los filtros TFF se utilizan principalmente para la clarificación primaria (microfiltración). Las membranas con un rango de corte de 0.1-0.65 μm (preferiblemente con un canal abierto) se han utilizado con éxito para retener células, restos celulares y otros contaminantes grandes. La mayoría de los equipos de filtros TFF son escalables linealmente y reutilizables después de la limpieza, lo que reduce significativamente el costo de los consumibles para el paso.
El paso de clarificación se encuentra entre los procesos anteriores y posteriores y a veces se pasa por alto durante el desarrollo del proceso de la vacuna porque se priorizan el tiempo y los recursos para otros pasos de purificación, como la cromatografía o la centrifugación en gradiente de densidad.
Incluso las patentes de procesos de fabricación de vacunas a menudo omiten el paso de clarificación. La eficiencia de la clarificación afecta directamente el rendimiento del proceso posterior. Un paso de clarificación mal optimizado puede afectar negativamente la capacidad del filtro esterilizado o puede acortar la vida útil de la resina cromatográfica. Hoy en día, las expectativas regulatorias más estrictas tienden a hacer que los fabricantes de vacunas produzcan vacunas más puras, bien caracterizadas pero asequibles. En este caso, cada paso debe recibir la atención que merece. Las tendencias actuales sugieren que el proceso anterior está avanzando hacia un sistema de expresión "más limpio" (es decir, las células cultivadas en medios sin suero reemplazan a los huevos) con mayor productividad y mayor densidad celular.
Los procesos de purificación posteriores se están simplificando y optimizando para aumentar la pureza del producto final. Para hacer frente a estos cambios, el paso de clarificación no puede convertirse en un cuello de botella. En este caso, la tecnología de filtración se enfrenta a un nuevo desafío de clarificación, abordando las cuestiones de mayor flexibilidad del proceso, la posibilidad de un solo uso y menores costos de inversión.
02 Aclaración sobre las vacunas contra el virus
Se han utilizado con éxito varios tipos de métodos de clarificación, ya sea solos o en combinación, para clarificar la cosecha en el extremo de alimentación de las vacunas.
Escala piloto: 1-20L, escala de producción: más de 20L
2.1 Precauciones para la clarificación de la vacuna contra el virus
Muchas vacunas contienen todas o parte de las partículas del virus para generar inmunidad contra la infección viral. Por lo general, se dividen en cuatro grandes categorías:
Vacuna viva atenuada (LAV), que se basa en una cepa debilitada del virus para reducir su virulencia. Los virus atenuados pueden replicarse en el organismo pero no son patógenos.
- Vacunas de virus inactivados (IV), que contienen virus inactivados químicamente o por luz ultravioleta para eliminar su infectividad. Las partículas virales pueden ser completas, divididas o purificadas (solo proteínas antigénicas).
- La vacuna de vector viral (VV) es un virus activo, no patógeno, que presenta el antígeno de un virus patógeno. Estas estructuras desarrolladas recientemente también se utilizan para aplicaciones de terapia génica.
Vacunas de partículas similares a virus (VLP), una clase específica de vacunas de subunidades virales que imitan la estructura general de las partículas virales pero no contienen material genético infeccioso.
En la mayoría de los casos, las partículas virales están completamente intactas durante la etapa de clarificación, incluso durante la lisis de la vacuna viral (la escisión generalmente se lleva a cabo más adelante, en un entorno más purificado).
El principal desafío de la clarificación viral es la recuperación de partículas virales de alto rendimiento mientras se eliminan de manera eficiente los restos celulares, los agregados grandes y los contaminantes insolubles. Como se describe en las siguientes secciones, hay varios factores que pueden causar la degradación o pérdida del virus. Además, puede resultar difícil confiar en el rendimiento viral debido a la alta variabilidad de los métodos de ensayo cuantitativo viral en esta etapa del proceso, especialmente para las vacunas LAV y VV. Para estas vacunas, el rendimiento viral a menudo se evalúa utilizando pruebas de infectividad como la prueba de placa o la prueba TCID50. El hecho de que algunos de los compuestos recolectados puedan interferir con la capacidad del virus para infectar células indicadoras aumenta la variabilidad de este enfoque cuantitativo.
2.2 Estrategia de clarificación de la vacuna contra el virus
Las vacunas virales varían mucho en tamaño, estructura, forma y sistemas de expresión (Tabla 3).
Como resultado, generalmente no existe una plantilla para los procesos posteriores, especialmente los pasos de clarificación. En teoría, se pueden seleccionar y combinar todas las técnicas disponibles (centrifugación a baja velocidad, microfiltración TFF, NFF) para clarificar el virus. De hecho, el éxito de los métodos de clarificación está influenciado por el sistema de expresión y las propiedades fisicoquímicas de los virus involucrados.
Recently, the high cell density process of viral vaccines is being explored. High cell density processes add to the challenge of clarification. Many treatment methods are by preconditioning, i.e. polymer-induced flocculation, precipitation, alternating TFF, etc. For example, Tomic et al. describe a method for high cell density collection (>El método de clarificación con polímeros catiónicos ({{0}} células/ml) redujo el área de filtración profunda en 4 veces en comparación con los métodos tradicionales. Esta técnica permite la recolección de fermentadores de gran capacidad sin el uso de centrífugas. De manera similar, Riske et al. demostraron que el tratamiento con quitosano de cultivos celulares de 40 L (0,02 %) que contenían 1,{{{0}} células/ml) condujo a un aumento de {{ ...
También mencionan que el quitosano parece mejorar la eficiencia de la clarificación al flocular partículas submicrónicas, que normalmente se depositan en centrífugas. Es probable que los métodos de pretratamiento y floculación sigan siendo parte de las futuras clarificaciones por filtración de vacunas. Los penetrantes, incluidos los azúcares, los glicoles y los aminoácidos, floculan preferentemente los virus. La floculación viral con solución osmótica seguida de una microfiltración de 0.2µ se puede utilizar como un proceso integral para la purificación de virus. Los penetrantes pueden estimular la agregación viral al reducir la capa de hidratación alrededor de las partículas para flocular partículas virales no encapsuladas hidrófobas y partículas virales encapsuladas. Aunque se ha demostrado que los penetrantes floculan los virus, el método tiene el potencial de ser una plataforma para la futura purificación de vacunas, y no se ha demostrado su viabilidad en la purificación de vacunas piloto o a gran escala. El método de pretratamiento por floculación, que probablemente seguirá siendo parte de la futura clarificación del filtro de vacunas, se realiza en un fermentador de 2L. Para poder utilizarse potencialmente en operaciones de producción a gran escala, estos métodos deben validarse a escala piloto y de producción.
2.2.1 Expresión del impacto del sistema
El método de clarificación depende principalmente del tipo de proceso previo y del sistema de expresión, que determina el tipo y el nivel de contaminantes que se deben eliminar. Las vacunas virales se producen generalmente en embriones de pollo mediante líneas celulares continuas de mamíferos o aves o células de baculovirus/insectos, que son un sistema de expresión más complejo. Algunos tipos de VLP también pueden producirse mediante otros sistemas de expresión heterólogos (bacterias, levaduras, células vegetales).
2.2.1.1 Virus producido en embrión de pollo
Las vacunas se producen en huevos desde hace décadas. Este trabajo se remonta a 1931, cuando Woodruff y Good Pasture utilizaron con éxito la membrana corioalantoidea de huevos fértiles como sustrato para el crecimiento viral. Hoy en día, muchas vacunas humanas y veterinarias todavía se producen utilizando este antiguo proceso. La más conocida es probablemente la vacuna contra la gripe estacional. El principio consiste en inocular huevos de gallina con virus de interés y luego replicarlos en la membrana corioalantoidea. Después de la reproducción, se recoge y purifica el líquido alantoideo rico en partículas virales.
El líquido alantoideo es un alimento clarificante difícil de obtener. Su alto contenido de minerales y proteínas (incluida la ovoalbúmina) le confiere una alta viscosidad. El líquido alantoideo también contiene compuestos esenciales de los tejidos de los embriones de pollo, como plumas, picos, vasos sanguíneos o células sanguíneas. Debido al alto contenido de sólidos, la centrifugación a baja velocidad es la opción preferida para la clarificación primaria, lo que normalmente da como resultado una tasa de recuperación de alrededor del 70 %. Sin embargo, también es posible la clarificación primaria mediante técnicas de filtración. Para la NFF, los filtros profundos a base de polipropileno y celulosa tienen buenas capacidades de recolección de líquido alantoideo. Los filtros de superficie fabricados a partir de filtros profundos a base de polipropileno o celulosa pueden tener una capacidad de 150-210 L/m² y reducir la turbidez del flujo de alimentación hasta 3 veces. El dispositivo TFF de canal de alimentación abierto también es adecuado para la clarificación de líquido alantoideo, ya que el dispositivo es más adecuado para una pérdida de presión mínima a través del canal de alimentación, lo que reduce el bloqueo del canal.
El paso de clarificación secundaria se puede realizar fácilmente con NFF. Una combinación de materiales de polipropileno, celulosa y fibra de vidrio generalmente muestra una buena eficiencia, y una alternativa al paso de clarificación secundaria es utilizar TFF y un dispositivo de membrana de microfiltración de 0,65 μm o 0,45 μm y operar el control de flujo osmótico. En este paso se puede utilizar un dispositivo TFF de canal abierto con una membrana de PVDF hidrófila o PES hidrófila.
Es importante tener en cuenta que las partículas virales pueden estar asociadas con material de desecho insoluble, lo que puede reducir significativamente la producción viral durante la clarificación. El uso de una solución salina puede reducir esta asociación entre los virus de la influenza y los fragmentos sólidos, lo que da como resultado un aumento de aproximadamente el doble en la producción sin afectar la integridad de las partículas virales.
2.2.1.2 Virus producidos en líneas celulares sucesivas de mamíferos y aves
Recientemente, algunas vacunas virales han dejado de lado los procesos basados en huevos para favorecer los procesos basados en cultivos celulares (especialmente para las vacunas contra la gripe). La razón principal de este cambio es evitar los problemas de producción de vacunas asociados con los huevos embrionarios (es decir, la escasez de suministro de huevos que puede producirse en caso de un brote de enfermedad avícola). Como resultado, actualmente se desarrollan muchos tipos de vacunas y vectores virales utilizando líneas celulares continuas de mamíferos o aves, líneas celulares convencionales (como las líneas celulares Vero, MDCK o HEK293) o líneas celulares patentadas.
Dependiendo del sistema de expresión, el virus puede permanecer dentro de la célula, requiriendo un paso de lisis celular, o puede permanecer fuera de la célula (lisis o gemación). La carga sólida y el contenido soluble obtenidos del cultivo celular son mucho más limpios que la fase líquida alantoidea. Como resultado, la tecnología NFF es más fácil de implementar y la capacidad es significativamente mayor. Sin embargo, la capacidad de filtración depende en gran medida de las condiciones del cultivo celular, como la densidad celular o la viabilidad celular en la cosecha. Estos parámetros afectan la cantidad de restos celulares y macroagregados que pueden obstruir los filtros profundos y las membranas, lo que resulta en una capacidad reducida.
Thomassen et al. ofrecen un buen ejemplo de clarificación NFF. Se utiliza en el proceso de producción de virus de la poliomielitis inactivados (IPV). Se utilizaron células Vero cultivadas en microportadores para la proliferación viral con una densidad celular de {{0}},78 x 106 células/ml TOI. Se utiliza una malla de acero inoxidable de 75 μm para la clarificación previa para eliminar los microportadores de la cosecha. La clasificación de doble capa se clarifica utilizando un filtro de densidad profunda (0,{2-2,0 μm), seguido de un filtro de grado esterilizado.
La unidad desechable escalable seleccionada se utilizó con éxito para la preparación de material de ensayo clínico de IPV Sabin a escala de 350 L. Dependiendo del serotipo del virus, se obtiene una tasa de recuperación del virus del 86 al 96 por ciento.
2.2.1.3 Partículas similares a virus o baculovirus producidas en el sistema celular de los insectos
La consideración de sistemas de células de insectos y baculovirus para la producción de vacunas a gran escala es relativamente nueva, pero está atrayendo un interés creciente en el campo de los vectores virales y las VLP. El principal beneficio de este sistema es que implica una producción de corta duración (no es necesario establecer líneas celulares) y segura (no se requiere ADN viral completo). También existen algunas desventajas, como la necesidad de eliminar el baculovirus y la estabilidad del producto.
Cervarix, una vacuna VLP contra la infección por el virus del papiloma humano producida por GlaxoSmithKline, es la primera vacuna humana que se produce comercialmente en células de insectos. Actualmente se están desarrollando varias vacunas basadas en VLP y vectores rAAV producidos en células de insectos infectadas con baculovirus. Las líneas celulares de insectos derivadas del gusano cogollero Spodoptera frugiperda (células Sf9 y Sf21) y del gusano cogollero Trichoplusia ni (células BTI-TN5B1-4) son las más utilizadas debido a su capacidad de crecer en suspensión, lo que simplifica la amplificación del proceso anterior. Después de crecer hasta la densidad deseada de células vivas, estas células se infectan con baculovirus recombinantes en la fase de crecimiento celular exponencial para la expresión de proteínas. El gran genoma de los baculovirus permite la expresión de cinco o más proteínas diferentes, lo que coincide con la complejidad de las VLP y los vectores virales.
Bernard et al. describieron el proceso posterior del cultivo de células de insectos. El proceso es muy variable, lo que refleja la diversidad de proteínas producidas con esta técnica. El primer paso de la secuencia de purificación está muy influenciado por las características de volumen del biorreactor (es decir, la densidad celular y la viabilidad) o por la naturaleza de la liberación del producto (secretado por gemación o lisis celular). La infección de células de insectos por baculovirus puede causar lisis celular en 3-5 días. La destrucción de células puede conducir a un aumento de la actividad proteolítica y otros factores ambientales que pueden conducir a la degradación de proteínas recombinantes.
Se han hecho intentos de desarrollar baculovirus con una menor capacidad para iniciar la lisis celular. El baculovirus lisa menos del 10 por ciento de los insectos infectados.
La lisis celular se puede realizar utilizando diferentes métodos, como congelación-descongelación, detergentes, homogeneizadores o tratamiento por ultrasonidos. Las células de insectos no tienen pared celular y, por lo tanto, se disuelven rápidamente. Aunque se ha informado sobre el tratamiento ultrasónico en muchos procesos de laboratorio, rara vez se utiliza a escala experimental o comercial. El método más común es utilizar un homogeneizador para destruir las células en presencia de un detergente de baja concentración (0.1% Triton X-100 o NP-40). El uso de detergentes y microfluidización u homogeneización por impacto osmótico se ha empleado con éxito en muchos procesos de fabricación a gran escala. Normalmente, las células de insectos se suspenden en tampones de lisis (50 mM TRIS pH 7,7, 300 mM NaCl, 5% glicerol, 0,2 mM PMSF e inhibidores de proteasa), durante los cuales se agrega Triton-X100 a una concentración final de 0,1%, seguido de ultrasonido suave o microfluidización. Luego se centrifuga la mezcla para eliminar las partículas insolubles.
En esta etapa, el lisado puede verse muy turbio y es difícil de filtrar utilizando un filtro de 0,45 μm. A veces, se pueden observar pérdidas de hasta un 30 % durante el paso de clarificación por pirólisis. La adición de benzoenzimas en la etapa de escisión ayuda a resolver el problema de filtración. La limpieza de las células con salmuera tamponada con fosfato después de la cosecha y una rápida "congelación-descongelación" en un tampón de craqueo con alto contenido de sal (500 mM de NaCl) ayuda a eliminar los agregados.
La clarificación de las VLP y los vectores virales producidos por células de insectos se produce después de la lisis celular (por tratamiento químico o mecánico), que libera no solo partículas virales sino también grandes cantidades de ácido nucleico celular. Las células de insectos pueden crecer a una alta densidad celular, de 1-9.10 6 células/ml. Por lo tanto, el paso de clarificación debe abordar una alta densidad celular, un alto contenido de ácido nucleico y, si es posible, la eliminación de partículas de baculovirus. Para complicar aún más las cosas, las VLP o los vectores virales y los baculovirus pueden tener tamaños similares (los baculovirus tienen 60-80 nanómetros de ancho y 300-400 nanómetros de largo). Debido a la alta densidad celular, la centrifugación ha sido la técnica preferida para la clarificación primaria durante décadas. Sin embargo, los procesos de membrana parecen ser una alternativa muy atractiva porque la escalabilidad es fácil de definir.
Los filtros profundos se han utilizado de manera eficaz en el proceso posterior de purificación de partículas de tres capas similares a rotavirus. A nivel de laboratorio, el método de ultracentrifugación por gradiente de densidad de CsCl se utiliza a menudo para purificar estas partículas complejas. Los investigadores evaluaron no solo el paso de clarificación del filtro profundo, sino también todo el proceso posterior (escisión con Triton X-100 y filtración profunda, seguida de ultrafiltración y exclusión por tamaño de partícula). Los resultados muestran que el rendimiento del gradiente de densidad de CsCl puede alcanzar el 37%.
El método ultracentrífugo es de aproximadamente 10%. Como otro ejemplo, se utilizaron fibras huecas de 0,45 μm y fibras de diámetro fino de 500 kDa para recuperar y concentrar partículas similares al VIH producidas en células de insectos. En este estudio, se optimizó la fuerza de corte de las fibras huecas en función de la integridad celular. Resultados Se estableció un proceso de baja fuerza de corte para reemplazar la ultracentrifugación en gradiente de azúcar de mesa.
El proceso tiene potencial para ser aplicado a la producción en masa. Los filtros profundos también se han utilizado con éxito en la producción de virus adenoasociados recombinantes. La lisis celular se realizó con un bloqueador de células mecánico de dos pistones, seguido de un tratamiento con nucleasa. En el paso de clarificación, se utilizó un elemento de filtro profundo de fibra de vidrio de 1,2 μm, seguido de dos capas de PES hidrófilo de 0,8 μm y PES hidrófilo de 0,2 μm. Los filtros de tamaño proporcional se utilizan para lotes de proceso desde tamaños más pequeños hasta 200 L. Los filtros profundos se han utilizado con éxito y también se ha informado que las clasificaciones TFF con películas planas o fibras huecas de 0,2 µm o 0,45 µm son muy efectivas.
El estudio de Tecnologica (IBET) en el Instituto de Biología Experimental de Oeiras en Portugal utilizó NFF para realizar la clarificación de VLP de hepatitis C expresadas por baculovirus sin centrifugación. Se utilizan filtros de polipropileno de clasificación nominal (10,5,0.6 y 0.3μm) para clarificar la recolección de VLP. Los mismos filtros con clasificaciones de poro de 0.6μm y 0.3μm se utilizan para la filtración en centros de recolección de VLP. Todos los filtrados estudiados se probaron para tasas de recuperación de VLP de VHC y se compararon los métodos de filtración recomendados. Los resultados se muestran en la Tabla 4.
Los resultados mostraron que el filtro de 5 μm-0.3 μm tuvo la recuperación de producto más alta (100%) para la alimentación de VLP de hepatitis C recolectada directamente. El filtro de polipropileno de 0,6 μm tuvo la recuperación de producto más alta (82%) para la alimentación central, y la eliminación de ADN de la célula huésped fue de aproximadamente el 70%.
2.2.1.4 Partículas similares a virus producidas en sistemas bacterianos o de levadura
El tipo de método de clarificación para las vacunas VLP expresadas en sistemas bacterianos o de levadura depende de la liberación de VLP a mediadores extracelulares. Si las VLP no pueden secretarse de manera eficiente, puede ser necesario realizar una lisis celular u otros pasos de extracción antes del paso de clarificación propiamente dicho. Si bien este es el estándar de oro en la industria de clarificación de proteínas, la centrifugación (continua o por lotes) expresada en sistemas bacterianos o basados en levaduras, más recientemente, los procesos de membrana se han convertido en una alternativa muy atractiva debido a su facilidad de escalabilidad y compatibilidad con tratamientos de un solo uso.
Richter y Topell explican el uso de centrifugación, TFF o una combinación de ambos al preparar VLP producidas en E. coli clarificada. En su trabajo, se utilizaron membranas TFF de 0,45 μm para diluir y clarificar los homogenizados de E. coli homogenizados a una temperatura de 5 grados. También señalan que la TFF basada en membrana es adecuada para manipular cosechas de alta viscosidad, preferiblemente utilizando unidades TFF con configuraciones de canal abierto.
La clarificación centrífuga también se ha evaluado como una alternativa al TFF. En este caso, el homogeneizado resultante no se diluyó y se centrifugó a 4 grados durante 10}5 minutos, 10000g. Sin transferir el recubrimiento blando, el sobrenadante se extrajo de las partículas y se volvió a centrifugar a 4 grados y 10.000 g durante 60 min. A continuación, el sobrenadante se retiró de las partículas presentes, se diluyó con tampón EB (43,89 mM Tris HCl, 6,11 mM Tris Base, 5,0 mM EDTA, 10 % (v/v) Triton X-100) 1:2 y se filtró en un dispositivo de filtro estéril de 0,22 μm. Procesamiento posterior. El proceso de ampliación para la producción de esta vacuna VLP en E. coli a escala de 800 L también se clarificó mediante la combinación de centrifugación y TFF.
La vacuna recombinante contra la hepatitis E HEV 239 ha sido autorizada en China para inmunizar a adultos de 16 años de edad o más. Los antígenos de la vacuna (VLP) se expresan en E. coli, y se ha demostrado que la ampliación del proceso de producción de antígenos se realiza a una escala de 50L. El producto se extrajo mediante craqueo de E. coli y los cuerpos de inclusión se separaron de los fragmentos celulares mediante un lavado intenso con un tampón que contenía 2% de Triton X-100 y luego se disolvieron con un homogeneizador de urea 4 M. El TFF clarifica las VLP del virus del papiloma humano producidas en Saccharomyces cerevisiae (15L). El lisado celular tratado con nucleasa se clarificó mediante microfiltración de flujo cruzado en modo de transfiltración utilizando un filtro de fibra hueca de 0,65 μm. El mismo proceso se utiliza en la producción de vacunas. Aunque solo un puñado de vacunas basadas en VLP han alcanzado una escala comercial, varias vacunas basadas en VLP están en desarrollo, la mayoría de las cuales se clarifican mediante centrifugación o tecnología de membrana.
Limitados por la influencia del espacio, compartiremos la segunda mitad del contenido en el próximo capítulo. En el próximo artículo, compartiremos algunos casos de clarificación de vacunas y el uso de componentes de membrana relevantes.
Como primera empresa en el circuito de localización, Guidling Technology ha acumulado suficiente experiencia relevante en la clarificación de vacunas. Guidling Technology es una empresa de desarrollo y producción centrada en la biofarmacéutica y el cultivo celular, la purificación y la separación. Los productos se utilizan ampliamente en biomedicina, diagnóstico, filtración de fluidos industriales, detección, clarificación, purificación y procesos de concentración; Guidling ha desarrollado con éxito tubos de centrífuga de ultrafiltración, casetes de membrana de ultrafiltración/microfiltración, filtros de eliminación de virus, dispositivos de filtrado de flujo tangencial, pilas de membranas profundas, etc., que satisfacen plenamente los escenarios de aplicación de la biofarmacia y el cultivo celular.
Nuestras membranas y filtros de membrana se utilizan ampliamente en la concentración, extracción y separación de prefiltración, microfiltración, ultrafiltración y nanofiltración. Nuestra amplia gama de líneas de productos, desde pequeñas filtraciones de laboratorio de un solo uso hasta sistemas de filtración de tipo de producción, pruebas de esterilidad, fermentación, cultivo celular y más, pueden satisfacer las necesidades de prueba y producción.