Tecnología de inactivación y eliminación de virus de productos sanguíneos.
Los productos sanguíneos son "componentes proteicos del plasma o componentes de células sanguíneas, tales como albúmina sanguínea humana, inmunoglobulina humana, factor de coagulación humano (natural o recombinante), concentrado de glóbulos rojos, etc., separados del plasma humano sano o del plasma humano específicamente inmune, purificado o elaborados mediante tecnología de ADN recombinante, para diagnóstico, terapia o inmunoprofilaxis pasiva". Los productos sanguíneos desempeñan un papel importante en las emergencias médicas, el rescate de heridos de guerra y la prevención y el tratamiento de algunas enfermedades específicas.
Antecedentes regulatorios
Las prácticas de garantía de seguridad deben garantizar que el medicamento final sea seguro para los reguladores y, en última instancia, para los pacientes y el público. En la década de 1990, la Conferencia de Coordinación Internacional (ICH 1998) emitió "Q5A: Viral Safety Assessment of Biotechnological productos de líneas celulares de origen humano o animal" (Q5A: Viral Safety Assessment), estableciendo un estándar mundial para la seguridad viral.
ICH Q5A describe un esquema de varios niveles para probar y aprobar la validación para lograr este objetivo. El programa de pruebas se centra en la recolección de bancos de células, materias primas y biorreactores, complementado con un análisis de riesgos del producto. Además de las pruebas, ICH Q5A requiere que la descontaminación aguas abajo se evalúe como una medida a prueba de fallos cuando no se detectan contaminantes aguas arriba. La verificación de la autorización garantiza que si algún virus evade el régimen de pruebas, puede eliminarse y/o inactivarse antes de terminar en el producto farmacéutico final.
Antecedentes del programa general de seguridad antivirus
En la fabricación (o bioprocesamiento) de biotecnología moderna, generalmente hay tres o cuatro operaciones unitarias en toda la secuencia purificada, capaces de eliminar o inactivar el virus. Esto incluye ciertos pasos cromatográficos (como proteína A o intercambio aniónico), cultivo de pH bajo o detergentes y filtros de retención de virus. No todos estos pasos eliminarán o desactivarán eficazmente todos los virus.
Por ejemplo, el cultivo con pH bajo suele ser ineficaz para la inactivación de virus sin envoltura, pero funciona bien para la inactivación de virus con envoltura. Bajo ciertas condiciones operativas, es posible que la columna de intercambio aniónico no pueda unir y eliminar virus isoeléctricos neutros de la corriente de producto, pero es eficaz contra virus ácidos.
Es una combinación de tres o cuatro operaciones unitarias independientes y ortogonales que juntas garantizan la seguridad viral de los productos biotecnológicos.
Generalmente se supone que un paso de procesamiento sólido, eficiente y confiable podrá eliminar o inactivar una gran cantidad de virus (generalmente definido como 4 log10 o más, donde el valor de reducción logarítmica o LRV se calcula como el log10 del total número de virus en la entrada dividido por el número total de virus en la salida). Sin embargo, el LRV no se puede utilizar como una única medida absoluta de la eficacia de un paso. Los datos pueden ser preliminares. Es fácil de modelar, relativamente insensible a los cambios en las condiciones del proceso y eficaz contra una variedad de virus (OMS 2004).
La filtración viral es ampliamente reconocida como un paso de proceso poderoso y efectivo y es un componente clave de la estrategia general para minimizar el riesgo de partículas virales exógenas y endógenas durante la fabricación de productos biotecnológicos.
Los filtros virales a menudo funcionan mediante fuertes mecanismos de retención basados en el tamaño. Basado en este poderoso mecanismo de acción, los filtros virales tienen más probabilidades que los pasos cromatográficos de proporcionar una retención viral predecible para una variedad de virus. Esto se debe a que es menos probable que el filtro se vea afectado por diferencias en las propiedades fisicoquímicas de diferentes virus y por las interacciones virus-resina reguladas por las condiciones de funcionamiento. Por lo tanto, el paso de filtración viral se usa comúnmente en procesos de purificación de proteínas terapéuticas recombinantes bien diseñados (EMEA 1996), que también han demostrado tener un rendimiento sólido en la industria de procesamiento de plasma.
Sin embargo, los productos sanguíneos son como un arma de doble filo, que no sólo salva miles de vidas, sino que también tiene la posibilidad de propagar enfermedades y representar una amenaza para la salud humana. Según las estadísticas, entre 1977 y 1984, al menos 30000 receptores de sangre en los Estados Unidos recibieron sangre infectada con el virus del SIDA. En 1985, 1.200 de cada 3000 hemofílicos en Francia estaban infectados con el SIDA a través de transfusiones de sangre o productos sanguíneos.
Según la Organización Mundial de la Salud, entre el 5% y el 10% de las infecciones por SIDA en todo el mundo son causadas por transfusiones de sangre o productos sanguíneos infectados por el SIDA. El primer caso de SIDA en China se infectó mediante el uso de productos sanguíneos importados infectados con el virus del SIDA. Además, también se ha informado de la transmisión de enfermedades de hepatitis B y C debido a transfusiones de sangre y productos sanguíneos.
1. Principales virus transmitidos por hemoderivados y sus características
Hay muchos tipos de virus que se transmiten a través de la sangre y los productos sanguíneos, como se muestra en la Tabla 1. Entre ellos, el VIH, el VHB y el VHC han sido motivo de preocupación en los círculos médicos nacionales y extranjeros debido a su alta tasa de infección y sus graves daños.
Debido a que la sangre y los productos sanguíneos tienen la posibilidad de propagar virus, ha afectado gravemente su aplicación en la prevención y el tratamiento de enfermedades. Por lo tanto, en la producción de hemoderivados se deben agregar procesos de inactivación y eliminación de virus para garantizar la seguridad de los hemoderivados.
2. Principales métodos de inactivación y eliminación de virus.
Para garantizar la seguridad de los productos sanguíneos, además de la selección de los donantes de sangre, la inmunización cuando sea posible y las pruebas estrictas de la sangre extraída y otras medidas, la inactivación y eliminación del tratamiento viral de los productos sanguíneos es un vínculo importante para garantizar la seguridad de los productos sanguíneos. seguridad de la transfusión de sangre. A continuación se describen en detalle varios métodos eficaces y de uso común para inactivar y eliminar virus.
I. Métodos de inactivación de virus
1. Método Pasteur
La base teórica de este método es que la tasa de destrucción de la estructura del virus es mucho mayor que la de la estructura de las proteínas mediante la selección de la temperatura y el tiempo de acción. Casi 50 años de resultados de uso clínico y experimentos recientes con animales han confirmado que la albúmina en solución después de un tratamiento térmico de 60 grados y 10 h, es decir, desinfección Pasteur, no solo puede inactivar el VHB, sino también inactivar el VHC y el VIH, lo que hace que la albúmina sea la más confiable. producto sanguíneo en seguridad viral.
Recientemente, el proceso de Pasteur se ha extendido a la producción de IVIG, FVI, FIX, fibrinógeno y otros productos. Bridonnccu et al. agregó este proceso de inactivación de virus al proceso de IVIG de producción de etanol a baja temperatura, es decir, el método Pasteur se implementó en condiciones sin estabilizador, baja sal y acidez, y el título de virus disminuyó en 5 Log. Simmonds y cols. probó el virus transmitido por transfusión (TTV) de las preparaciones concentradas de FVⅢ y FIX utilizadas clínicamente en el Reino Unido, y encontró que la tasa de detección de TTV de productos sin inactivación del virus Pasteur fue del 50% al 75%, y la tasa de detección positiva de productos después de la inactivación de Pasteur fue 0.
La tasa positiva de TTV fue del 27% en 84 pacientes con hemofilia en el Reino Unido que usaron productos de factor de coagulación no inactivados, mientras que solo 1 de 19 pacientes que usaron productos de factor de coagulación inactivados por virus fue positivo, con una tasa de detección positiva del 5%. Por tanto, el proceso de inactivación del virus es muy eficaz para mejorar la seguridad de los productos sanguíneos.
2. Disolvente orgánico combinado con tensioactivo (método S/D)
This method was first established by Horowitz et al., a blood center in New York, the principle is that organic solvents can make lipids fall off the surface of the virus, so that the structure of the virus is destroyed and the infection activity is lost. The common S/D method uses n-butyl triphosphate (TNBP) in combination with different surfactants such as Tine80, Triton X100, and sodium cholate. The effect of S/D method on the inactivation of lipid-coated viruses in blood products has been confirmed. For example, when FI concentrated preparations were treated with 0.3%TNBP and 0.2% sodium cholate at 24℃ for 6 h, the inactivation of HBV and HCV was >4 Log,HIV >4.5 Log, and the inactivation of VSV and Sindbis viruses was >4.5 Log, and the recovery rate of FVIII was >90%. Se ha demostrado que un gran número de productos sanguíneos inactivados mediante el método S/D son seguros y fiables mediante aplicaciones clínicas a largo plazo, por lo que se utilizan ampliamente. Sin embargo, este método no tiene capacidad de inactivación contra el parvovirus B19, el VHE y otros virus no recubiertos con lipo.
3. Método de inactivación por calor seco
La inactivación por calor seco significa que la preparación liofilizada se trata calentando y el virus muere mediante calor seco. Los métodos de calor seco comúnmente utilizados son el método de calentamiento de 60 grados ~80 grados, 10~72 h y el método de tratamiento de 80 grados, 72 h. Ya a principios de la década de 1980, era útil calentar la preparación concentrada liofilizada de FVIII y el complejo de protrombina a entre 60 y 80 grados durante 10 a 72 h. Sin embargo, se ha demostrado que este método no puede inactivar completamente el VHB, el VHC y el VIH. Se ha demostrado que el tratamiento con calor seco a 80 grados y 72 h es eficaz para inactivar el VHB, el VHC y el VIH. También ha habido informes recientes de preparaciones liofilizadas de factores de coagulación tratadas a 100 grados. Xu Jinbo et al trataron IgG a 100 grados durante 30 minutos e inactivaron el virus de la estomatitis vesicular 8.2 Log. Algunas personas liofilizan el FVIII a 68 grados durante 72 h, en estado seco y luego lo calientan a 100 grados durante 0,5 ~ 1 h. Este método es relativamente económico.
4. Método fotoquímico
This method was first proposed by Matthews et al. The principle is that some photosensitizers have a strong affinity for the surface of the virus and the structure of the viral nucleic acid, and are easily activated under appropriate wavelength of light, thus destroying the structure of the virus in contact with them through photochemical action. The photosensitizers that have been used include: hemacoline derivatives, psoralide derivatives, phenothiazines, phthalocyanines, and cyanine 540, etc. The main feature of this method is that it can be used to inactivate the virus of whole plasma, and the inactivation of the virus of platelet products is the current research focus. Scientists from the Department of Experimental Medicine at the University of California in the United States have screened out a new psoralen derivative S-59 among more than 100 chemical modifications of psoralen. The platelets were irradiated with 150 um S-59 combined with 3 J/cm2 UVA, which could inactivate >6.7 Log of free HIV and >6.6 Registro de células unidas al VIH y plaquetas se mantuvieron en buen estado después de 7 días de conservación funcional in vitro, que ha sido aprobada por la FDA para ensayos clínicos.
Entre estos métodos, el método de desinfección Pasteur y el método S/D están aprobados por la FDA de los Estados Unidos y se utilizan ampliamente en el mundo. El método de inactivación por calor seco es principalmente adecuado para la inactivación viral de preparaciones liofilizadas. El método fotoquímico tiene un fuerte efecto de inactivación sobre los virus recubiertos de lípidos, se ha utilizado en la inactivación de virus en plasma completo en Europa y tiene amplias perspectivas para la inactivación de virus en componentes de células sanguíneas. Sin embargo, todos estos métodos tienen sus propias desventajas, como que la esterilización Pasteur no es ideal para la inactivación de algunos virus resistentes al calor; El método S/D no pudo inactivar eficazmente el virus no recubierto de lipo. El método fotoquímico dañó significativamente la actividad de algunas proteínas plasmáticas. El uso clínico actual de las investigaciones de seguimiento muestra que ningún método de inactivación de virus puede garantizar que los productos sanguíneos estén absolutamente libres del riesgo de transmisión de virus.
I. Proceso de eliminación de virus
En la producción de productos sanguíneos, un proceso de inactivación no puede inactivar todos los virus; Además, el virus en sí es una proteína heteróloga, por lo que su entrada con el producto producirá reacciones adversas; Al mismo tiempo, debido a limitaciones de nivel técnico, todavía hay virus cuyas características no se encuentran o no se comprenden, por lo que los métodos de inactivación de virus existentes no pueden garantizar el efecto de inactivación de estos virus. Por lo tanto, la inactivación por sí sola no puede garantizar la seguridad del producto y debe eliminarse del mismo. Por eso, la tecnología de eliminación de virus está recibiendo cada vez más atención. A continuación se describen brevemente dos procesos de eliminación de virus eficaces y de uso común.
1. Tecnología cromatográfica
La tecnología cromatográfica se refiere al uso de varios componentes y diferencias de afinidad o interacción de fase estacionaria, para lograr la separación de varios componentes. Como tecnología avanzada para la producción de productos sanguíneos, la cromatografía en sí misma tiene el efecto de eliminar virus, especialmente la cromatografía de afinidad y la cromatografía de intercambio iónico. Para la cromatografía de intercambio iónico, la elución tiene ventajas sobre la penetración en la eliminación de virus. La Tabla 2 muestra las estadísticas de datos de la tasa de eliminación de HAV mediante tecnología cromatográfica en el proceso de producción de albúmina por parte de CSL Company en Australia. Como puede verse en la Tabla 2, la cromatografía de intercambio iónico y la filtración en gel son más efectivas para eliminar HAV, con una tasa de eliminación total de 10,9 Log.
En la producción de FVIII, Baxter Healtheare realiza cromatografía de inmunoafinidad utilizando geles tratados con anticuerpos anti-FVIII, que pueden eliminar (4,2±0.1)Log y (5,3±0.9)Log de no -virus recubiertos de lípidos como PPV y HAV, respectivamente.
2. Filtración de nanopelículas
Para algunos virus con un diámetro de superficie pequeño, como el VHA y el parvovirus B19, la filtración con nanomembranas es el método de eliminación más eficaz. Aprovecha la diferencia de tamaño entre proteínas y virus y la adsorción de virus por la membrana del filtro para aislar virus. Se llevó a cabo un estudio de laboratorio en el sitio de suministro de sangre de Sanquin en los Países Bajos sobre la eliminación de virus agregando una filtración de nanomembrana Planova 15N de un solo paso y dos etapas al proceso de producción del complejo de protrombina. Se descubrió que las tasas de eliminación de VIH, VHA y otros virus aumentaron en diversos grados después de la filtración con nanomembranas (consulte la Tabla 3).
Sin embargo, pueden surgir los siguientes problemas cuando se aplica este método a la producción industrial: primero, debido a la alta viscosidad del producto y la presencia de proteínas de gran diámetro, el tamaño de poro de la membrana seleccionada por el filtro no debe ser demasiado pequeño. limitando así la eliminación de virus de pequeño diámetro como el VHC; En segundo lugar, la estabilidad del control del tamaño de los poros de la membrana en el proceso de producción del filtro afectará la eliminación del virus. En tercer lugar, cuando se bloquea la abertura de la membrana más pequeña que el diámetro de la partícula de virus, el caudal del producto se reducirá, lo que afectará el rendimiento. Por lo tanto, la selección de membranas cuyas propiedades y tamaño de poro sean adecuados para las necesidades de los productos procesados es un factor importante para determinar si la filtración con nanomembranas puede eliminar virus.
3. Discusión
Bajo la premisa de garantizar la calidad de la fuente de sangre, el proceso de inactivación y eliminación del virus es un medio importante y necesario para garantizar la seguridad de los productos sanguíneos. El uso de un solo proceso de virus inactivado no puede garantizar absolutamente la seguridad de los productos sanguíneos. Sobre la base de la tecnología de inactivación de virus, se agregó tecnología de eliminación de virus, como la cromatografía y la filtración con nanopelículas, la tasa de eliminación de virus aumentó considerablemente y el efecto de inactivación y eliminación de virus mejoró significativamente. En la actualidad, Europa ha propuesto claramente que en el proceso de producción de productos sanguíneos se debe utilizar al menos una inactivación y eliminación de virus para garantizar la seguridad de los productos sanguíneos.
En China, la mayoría de los fabricantes de productos sanguíneos solo utilizan un proceso de virus inactivado en el proceso de producción, como el método de desinfección Pasteur, el método S/D, etc., pero no utilizan el proceso de eliminación de virus, lo que afecta gravemente la calidad de los productos sanguíneos. Con la adhesión de China a la OMC, el proceso de producción y los estándares de calidad de los productos sanguíneos nacionales estarán en línea con los del mundo; de lo contrario, no podrá garantizar la cuota de mercado nacional existente, pero tampoco podrá competir con productos similares en otros países del mundo. mercado internacional.
Por lo tanto, los fabricantes de productos sanguíneos de China deben mejorar el proceso de producción, fortalecer la inactivación y eliminación del virus, para garantizar plenamente la calidad y seguridad del producto. Por lo tanto, la tendencia entre los fabricantes chinos de productos sanguíneos será utilizar la cromatografía para purificar los productos sanguíneos y eliminar virus para garantizar la seguridad de los productos sanguíneos.
Acerca de Guidling
Guidling Technology es una empresa nacional de alta tecnología que se centra en productos biofarmacéuticos, cultivo celular, purificación y concentración de biomedicina, diagnóstico y fluidos industriales. Hemos desarrollado con éxito dispositivos de filtrado centrífugo, casetes de ultrafiltración y microfiltración, filtros de virus, sistemas TFF, filtros de profundidad, fibras huecas, etc. que satisfacen completamente los escenarios de aplicación de productos biofarmacéuticos, cultivos celulares, etc. Nuestras membranas y filtros de membrana se utilizan ampliamente en concentración, extracción y separación de prefiltración, microfiltración, ultrafiltración y nanofiltración. Nuestras numerosas líneas de productos, desde filtración de laboratorio pequeña y de un solo uso hasta sistemas de filtración de producción, pruebas de esterilidad, fermentación, cultivo celular y más, satisfacen las necesidades de prueba y producción. ¡Guidling Technology espera cooperar con usted!