Aplicación de ultrafiltración en la producción de vacuna contra la rabia humana

Para promover la aplicación de la ultrafiltración en la producción de la vacuna contra la rabia humana, se utilizó un casete de membrana de ultrafiltración de 300 kDa para concentrar la solución de recolección del virus de la rabia y detectar la recuperación del antígeno, la tasa de eliminación de endotoxinas y la tasa de eliminación de proteínas del huésped después de la ultrafiltración. Los resultados mostraron que bajo la presión adecuada, la solución de recolección del virus de la rabia se concentró 80 veces, se eluyó 25 veces, la tasa de recuperación del antígeno fue 86.2 %, la tasa de eliminación de endotoxinas bacterianas fue del 87,5 % ~ 88,7 % y la tasa de eliminación de proteínas del huésped fue del 91,6%.

 

Prefacio

 

La rabia es una enfermedad zoonótica tradicional y antigua causada por el virus de la rabia (RV), con una tasa de mortalidad de hasta el 100%. En la actualidad, no existe ningún tratamiento eficaz para la postexposición (es decir, daños a la piel y las membranas mucosas) aparte de la vacuna de emergencia y la vacunación con inmunoglobulinas. La principal fuente de rabia en humanos son las mordeduras de animales enfermos o potencialmente infectados (principalmente perros). La tasa de mortalidad por rabia en China ocupa el segundo lugar en el mundo y la rabia es uno de los problemas que amenaza la seguridad de la salud pública en nuestro país. La glicoproteína capsular del virus de la rabia, que es el único antígeno clave que induce la producción de anticuerpos neutralizantes protectores, ha sido el foco de la investigación y el desarrollo de nuevas vacunas y nuevas tecnologías de diagnóstico y tratamiento del virus de la rabia.

 

El virus de la rabia pertenece al género de los virus de la rabia de la familia de los rabdovirus. La forma de la nucleocápside es elástica, la nucleocápside es helicoidalmente simétrica y la superficie tiene una envoltura que contiene ARN monocatenario. Es el patógeno que causa la rabia. El virus de la rabia tiene dos antígenos principales: uno es el antígeno glicoproteico en la membrana externa del virus, que puede unirse al receptor de acetilcolina para hacer que el virus sea neurotóxico y producir anticuerpos neutralizantes y anticuerpos inhibidores de la hemaglutinación en el cuerpo, y los anticuerpos neutralizantes tienen un efecto protector; El otro es el antígeno riboproteico interno, que puede hacer que el cuerpo produzca anticuerpos de unión al complemento y precipitina, y no tiene ningún efecto protector.

 

La endotoxina es un tipo de sustancia lipopolisacárida (LPS), que tiene resistencia al calor y estabilidad química y no es fácil de destruir. Si hay una cierta concentración de endotoxina en la vacuna, provocará fiebre intensa e incluso la muerte después de la vacunación, por lo que el contenido de endotoxina en la vacuna debe reducirse tanto como sea posible. La edición de 2005 de la Farmacopea China (Parte III) determinó que el valor de control del índice calificado de endotoxina de la vacuna contra la rabia no debe ser superior a 100 UE/dosis. Con el rápido desarrollo de la tecnología de separación por membranas, la aplicación de la tecnología de separación por membranas de ultrafiltración para reducir el contenido de endotoxinas en las vacunas se está generalizando cada vez más en la industria farmacéutica.

 

Una vacuna contra la rabia es una vacuna contra la rabia. Por lo general, existen tres tipos de vacunas contra la rabia, incluida la vacuna de células Vero purificadas, la vacuna de células diploides humanas y la vacuna de cultivo celular primario. La vacuna contra la rabia se elabora inoculando el virus de la rabia fijado en la matriz celular, después del cultivo, la recolección, la concentración, la inactivación, la purificación y la adición del estabilizador adecuado. La función principal de la vacuna contra la rabia es estimular al cuerpo para que produzca una respuesta inmune rápida y produzca anticuerpos protectores contra el virus de la rabia, a fin de prevenir la infección causada por el virus y reducir el riesgo de enfermedad.

 

 

El proceso de producción de la vacuna desempeña un papel importante para garantizar la calidad de la vacuna, especialmente la cuantificación de algunos indicadores en el proceso de producción es más importante. En el proceso de producción de la vacuna contra la rabia humana, la tecnología de concentración por ultrafiltración es un medio necesario para producir la vacuna contra la rabia humana. El uso de una membrana de ultrafiltración de apertura razonable para la concentración de ultrafiltración puede eliminar eficazmente la endotoxina y la proteína del huésped y retener el antígeno RV, lo que favorece la producción de vacunas y la mejora de la calidad. La masa molecular relativa de las moléculas de RV es de 350 kDa a 460 kDa y, en teoría, el RV puede quedar completamente atrapado mediante concentración de ultrafiltración utilizando un casete de membrana con un peso molecular de interceptación de 100 kDa y 300 kDa. La endotoxina a menudo forma una estructura agregada en diferentes soluciones acuosas; debido al grado de agregación, el tamaño molecular es diferente. La masa molecular relativa del monómero de endotoxina es de 10 kDa a 20 kDa, y la masa molecular relativa de su forma de polimerización es de 300 kDa a 1000 kDa o más de 1000 kDa. Según la diferencia de peso molecular, el antígeno RV de la vacuna contra la rabia humana se retuvo y la endotoxina y la proteína del huésped de la vacuna contra la rabia humana se eliminaron mediante una membrana de ultrafiltración de 300 kDa.

 

En este experimento, se utilizó un casete de membrana de ultrafiltración con una apertura de 300 kDa y un área de membrana de 0,11 m2 como tratamiento de muestra pequeña para concentrar los productos intermedios de la vacuna contra la rabia humana y el flujo de membrana, la eficiencia del tratamiento, la concentración múltiple, la interceptación de antígenos y la eliminación de endotoxinas. y se probaron la eliminación de proteínas del huésped.

 

2Método de materiales

 

2.1 Materiales experimentales

Cepa CTN-IV del virus fijo del virus de la rabia; células vero; 0.Hidróxido de sodio 5 M; Casete de membrana de ultrafiltración de 300kDa (material PES, área de membrana de 0,11 m²).

 

2.2 Métodos experimentales

2.2.1 Preparación de la solución de recolección de virus

Las células Vero congeladas se resucitaron en agua tibia a 37 grados ~ 39 grados, se extrajo la suspensión celular y luego se añadió a un medio de cultivo 199 que contenía suero de ternera inactivado al 10 %. Se cultivaron células monocapa uniformes a 37 grados. La cepa CTN-IV se inoculó con virus de la rabia en una proporción de 0.1 mol/l y se cultivó a 37 grados. Después de 48 h, se descartó el medio de cultivo y se añadió medio de cultivo 199 que contenía albúmina de sangre humana al 0,1 % para mantener el cultivo entre 33 y 35 grados. Coseche el veneno de la enfermedad una vez cada 3d-5días y combine los múltiples fluidos de recolección.

 

2.2.2 Instalación del casete de membrana

Instale el casete de membrana y conecte el cableado como se muestra en la siguiente figura.

 

2.2.3 Lavado con agua

Cierre la válvula de entrada, la válvula de retorno y la válvula pasante, e inserte el extremo de retorno y el tubo del extremo pasante en el tanque de líquido residual. Llene el tanque de admisión con 1L de agua para inyección.

Abra las válvulas de entrada y retorno, cierre las válvulas pasantes, abra la bomba, limpie la línea de retorno con un 10% del volumen de agua purificada o agua para inyección y mantenga la presión de entrada a 0,35 bar (5 psi).

Abra la válvula del filtro, cierre la válvula de retorno y utilice el agua de inyección restante para limpiar el tubo del filtro, manteniendo la TMP en 0.35 bar.

 

2.2.4 Desinfección

Cierre la válvula de entrada, la válvula de retorno y la válvula de transmisión, e inserte las líneas del extremo de retorno y del extremo de transmisión en el tanque de líquido residual. Llene el tanque de admisión con 2 litros de solución limpiadora.

Abra las válvulas de entrada y retorno, cierre las válvulas pasantes, abra la bomba, limpie la línea de retorno con 200ml de hidróxido de sodio 0,5 M y mantenga la presión de entrada a 0,35 bar (5 psi). .

Abra la válvula pasante, cierre la válvula de retorno y limpie el tubo pasante con un volumen de 200 ml de solución limpiadora, manteniendo la TMP en 0,35 bar.

Luego, el extremo de retorno y el tubo del extremo pasante se insertan en el tanque de líquido para una limpieza cíclica. Realice un ciclo de limpieza con 1 ~ 1,5 veces el caudal tangencial del proceso durante 30 minutos.

Escurrir 0.5 M de hidróxido de sodio y enjuagar con agua para inyección según 2.2.4 hasta neutralidad.

 

2.2.5 Prueba de flujo de agua

Agregue agua purificada al tanque de admisión, mida y registre la temperatura del agua en el tanque de admisión. Inserte el extremo de retorno en el tanque. Arranque la bomba y ajuste la velocidad de la bomba y la válvula de retorno para lograr una diferencia de presión transmembrana de 0.35 bar (5 psi). Utilizando un cilindro, mida y registre el caudal en el extremo pasante en ml/min. Ajuste la velocidad de la bomba y la válvula de retorno para obtener una presión diferencial transmembrana de 1 bar (15 psi). Utilizando un cilindro, mida y registre el caudal en el extremo pasante en ml/min.

Para estandarizar el valor del flujo de agua, divida el valor del flujo de agua calculado por la diferencia de presión transmembrana y multiplique el factor de corrección de temperatura en la siguiente tabla.

 

2.2.6 Concentración de ultrafiltración

Lave el agua del sistema con la tapa amortiguadora. Ciclo durante 5 minutos para ajustar el pH y la estabilidad iónica del sistema. Si es necesario ajustar la temperatura, continúe el ciclo hasta que la temperatura del sistema esté estable.

Agregue el líquido de alimentación al tanque de entrada, establezca un caudal de alimentación (por ejemplo, 400 LMH) y pruebe el caudal pasante a diferentes valores de TMP. Según los datos de la prueba, las curvas se dibujaron con TMP como abscisa y Flux como ordenada.

Dirija la tubería de extremo a un recipiente o drenaje adecuado, como tanques de recolección de extremo, tanques de líquidos residuales y drenajes de proceso.

Registre el peso inicial del líquido de alimentación en el tanque de alimentación, encienda la bomba de alimentación y haga circular lentamente el líquido de alimentación durante 3 a 4 minutos. La recirculación puede ayudar a eliminar el aire residual en la ruta del flujo, maximizando así el rendimiento de la película.

Abra la válvula pasante, aumente lentamente la velocidad de la bomba hasta alcanzar el caudal tangencial óptimo y ajuste la válvula de retorno para lograr el TMP óptimo del sistema.

Luego coloque el tubo en el recipiente de recolección, comience a cronometrar el momento en que el líquido ingresa al recipiente y registre la presión de entrada y retorno a intervalos apropiados, y registre la calidad del líquido a lo largo del tiempo en el extremo de retorno y en el extremo pasante para calcular el valor instantáneo. tasa de flujo.

La concentración de ultrafiltración de la muestra se completa cuando el volumen líquido de la alimentación se reduce al volumen de concentración objetivo.

 

2.2.7 Diálisis

Coloque el tubo de entrada, el tubo de reabastecimiento y el tubo de retorno en el tanque de admisión, coloque el tubo de transmisión en el recipiente de recolección y coloque el recipiente de recolección en la balanza para limpiarlo.

Abra la válvula de retorno, arranque la bomba de entrada, abra la válvula pasante, ajuste la velocidad de la bomba y TMP al valor apropiado. Abra la bomba de reabastecimiento, mantenga sin cambios el volumen de líquido en el tanque de admisión e inicie la diálisis de igual volumen. Comience a cronometrar cuando el líquido ingresa al recipiente, registre la presión en el extremo de entrada, el extremo de retorno y la masa del líquido en el intervalo de tiempo apropiado, y obtenga el caudal instantáneo mediante cálculo.

 

2.2.8 PIC

Primero enjuague con tampón, luego enjuague con agua para inyección (operación 2.2.3), luego limpie con agente de limpieza (operación 2.2.4) y finalmente enjuague con agua para inyección (operación 2.2.3).

 

2.2.9 Prueba de flujo de agua

El funcionamiento es el siguiente: 2.4.5.

 

2.2.10 Preservación del casete de membrana

Almacenamiento a corto plazo (menos o igual a 3 días), mantenga el casete de membrana en el dispositivo y use la solución de almacenamiento para realizar un ciclo de 10 a 15 minutos, cierre la válvula del sistema, corte el suministro de energía a la bomba de líquido y asegúrese de que el tanque de entrada de líquido esté correctamente sellado.

Si el tiempo de almacenamiento es de 3 días a 1 mes, retire el casete de membrana del dispositivo y séllelo en una bolsa de plástico u otro recipiente hermético. Agregue entre 50 y 100 ml de la solución de almacenamiento a una bolsa de plástico o recipiente hermético y ciérrelo. O puede sumergirse directamente en la solución de almacenamiento. La siguiente tabla recomienda las condiciones de almacenamiento.

 

3 Resultados y análisis

 

3.1 Investigación de los factores que influyen en la eficacia de la eliminación de pirógenos

Presión de operación de ultrafiltración: se ejecutaron 15 lotes de prueba de forma continua. En cada lote, la presión de filtración se mantuvo a 5, 10, 15 y 2{{10}}psi durante la ultrafiltración, y el líquido de recolección de virus se concentró 30 veces y se eluyó con líquido tampón. (10 veces el volumen) en flujo continuo. Como se muestran los resultados en la tabla siguiente, la tasa de eliminación de endotoxina fue inferior al 87,0 %, la tasa de recuperación del antígeno se mantuvo estable en el 86.0 %, y la tasa de eliminación de la proteína del huésped fue estable en 90,0 %, lo que indica que las diferentes presiones operativas tuvieron poca influencia sobre el efecto de la recuperación de antígenos, la eliminación de endotoxinas y la eliminación de proteínas del huésped.

Relación de concentración de ultrafiltración: se ejecutaron continuamente 15 lotes de prueba. En cada lote, el líquido de recolección de virus se concentró 30 veces, 50 veces, 80 veces y 100 veces respectivamente durante la ultrafiltración. La presión de filtración se mantuvo a 20 psi y el líquido tampón (10 veces el volumen) se eluyó en flujo continuo. Como se muestran los resultados en la siguiente tabla, la tasa de eliminación de endotoxina osciló entre 53,3% y 86.9%, la tasa de recuperación de antígeno se mantuvo estable en 86.0% y la tasa de eliminación de proteína del huésped se mantuvo estable en 91,0%. En el muestreo segmentado, no se detectó ningún antígeno en la solución de transmisión y menos del 10% de la proteína del huésped permaneció en la solución concentrada del virus. La concentración de endotoxina en la solución concentrada de virus aumentó con el aumento de los tiempos de concentración, y la tasa de eliminación de endotoxina fue la más alta en la muestra concentrada de 80 veces, y el fabricante también pudo considerar la concentración de 100 veces, lo que no solo mejoró la eficiencia de producción y redujo el costo, pero también cumplió con los requisitos de producción de vacunas.

 

3.2 Agotamiento del flujo del casete de membrana y regeneración de limpieza

Después del tratamiento, la tasa de recuperación del flujo de la membrana fue del 92,6%. La primera tasa de recuperación del nuevo casete de membrana es normal, de acuerdo con las propiedades de observación actuales del líquido de alimentación, la predicción posterior de los tiempos segundo y NTH, la tasa de recuperación de flujo del casete de membrana estará cerca de los datos después de este tratamiento, y tienden a ser estables. Dentro de las 2 horas de un solo uso, el agotamiento del casete de membrana fue ideal y solo el 10 % del flujo de la membrana se agotó en el funcionamiento general.

3.2.1 Agotamiento del flujo en el proceso de tratamiento del casete de membrana

3.2.2 Resultado de la limpieza y regeneración del casete de membrana

 

Acerca de Guidling

 

Guidling Technology es una empresa nacional de alta tecnología que se centra en productos biofarmacéuticos, cultivo celular, purificación y concentración de biomedicina, diagnóstico y fluidos industriales. Hemos desarrollado con éxito dispositivos de filtrado centrífugo, casetes de ultrafiltración y microfiltración, filtros de virus, sistemas TFF, filtros de profundidad, fibras huecas, etc. que satisfacen completamente los escenarios de aplicación de productos biofarmacéuticos, cultivos celulares, etc. Nuestras membranas y filtros de membrana se utilizan ampliamente en concentración, extracción y separación de prefiltración, microfiltración, ultrafiltración y nanofiltración. Nuestras numerosas líneas de productos, desde filtración de laboratorio pequeña y de un solo uso hasta sistemas de filtración de producción, pruebas de esterilidad, fermentación, cultivo celular y más, satisfacen las necesidades de prueba y producción. ¡Guidling Technology espera cooperar con usted!